抗体纯化、选择和稀释比度 | RIP/ChIP专题

1 抗体形式及抗体纯化对于血清、腹水和组织培养上清的澄清，离心和过滤是基本的实验室技术。这些技术可以去除会阻塞层析柱的脂类和小颗粒物质。对于某些样品，缓冲液置换和除盐也是必要的步骤。硫酸铵沉淀作为更进一步的预处理步骤，经常用于浓缩腹水中的免疫球蛋白。1.1 抗血清多克隆抗体通常是未经纯化的，称为血清或抗血清。抗血清是指已经除去了凝血蛋白和血红细胞的免疫宿主的血液。抗血清包含所有种类的抗体/免疫球蛋白以及其它血清蛋白。它所包含的不仅有识别靶抗原的抗体，还有识别非靶抗原的抗体，在免疫分析中有时会发生非特异性反应。由于这个原因，粗制抗血清通常要进行纯化，以去除血清蛋白，增加能特异和靶抗原相结合的免疫球蛋白的比例。1.2 组织培养上清单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞培养（细胞分泌性抗体）并收获杂交瘤组织培养上清来获得。1.3 腹水单克隆抗体可以通过在小鼠（或大鼠）的腹腔中生长杂交瘤细胞而产生。杂交瘤细胞注射入小鼠以后，就会在小鼠腹腔繁殖并产生液体（腹 水）。这种腹水就包含了高浓度的可收获抗体，比杂交瘤细胞培养有更高的抗体产量。1.4 抗体纯化多克隆抗血清或单克隆腹水/组织培养上清通常通过下述三种方法中的一种来进行纯化：1.4.1 蛋白A/G纯化蛋白A/G纯化是应用金黄色葡萄球菌的蛋白A或链球菌的蛋白G对免疫球蛋白Fc段的高亲和性。蛋白A/G纯化从粗制抗血清中去除了血清蛋白，但没有去除非特异的免疫球蛋白组分。结果蛋白A/G纯化的抗血清仍然具有一小部分不期待的交叉反应性。1.4.2 亲和纯化亲和纯化就是通过相似性分离某一特定蛋白或具有相似特征的一组蛋白。这种分离蛋白的技术是基于在蛋白和耦合于层析介质上的特定配基之间的一种可逆的相互作用。抗原亲和纯化的优势是免疫球蛋白能够特异性地同刺激它产生的抗原进行结合，结果消除了大量的非特异免疫球蛋白成分，将能特异与靶抗原相结合的免疫球蛋白成分富集。因此亲和纯化后获得的主要是含所期待的特异性免疫球蛋白。1.4.3 预吸附多克隆抗体有时要经过预吸附。也就是说它们要被不同物种来源的其它蛋白或血清吸附，以消除可能的交叉反应的抗体。这样纯化后的抗体 纯度和特异性应很高，任何交叉反应都被显著减少。2 抗体选择和稀释比度对于任何一种特定的靶抗原，都有不止一种有效抗体。为了缩小选择范围，实验中通常要考虑以下几个方面：●分析或者应用类型；●样品的性质；●样品的种类；●抗体宿主的种类；●抗体的标记和检测；2.1 用途抗体数据表所显示的用途都是已经得到检测证明可以发挥作用的。如果某项用途没有列出，并不意味着抗体不合适，而是还没有检测是否有该项用途或不知道抗体如何发挥作用。如果已经检测并证明无效也会在表中列出。2.2 样品的性质样品的性质会告诉您哪个抗体最合适，至少要考虑以下两个方面：a.要检测的蛋白区域。刺激宿主动物产生抗体的具有免疫原性的物质种类繁多，包括全长的蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物机体（例如细菌）或细胞。免疫原通常在数据表中会有显示（尽管在很多例子中由于专利原因找不到关于免疫原的详细描述）。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域，那就要求选择的抗体是由该特异片段或区域或者包含该特异片段或区域的免疫原刺激产生的。如果要通过 FACS 去检测活细胞表面蛋白，则要求选择的抗体是由蛋白的细胞外区域刺激产生的。b.样品的处理工艺。有些抗体要求样品先进行特殊处理。例如，许多抗体只识别降解或变性蛋白，可能因为这样会暴露藏在二次或三次折叠后蛋白内部的抗原表位。另一方面，有些抗体仅识别自然折叠状态蛋白上的表位。当搜寻用于免疫组化的抗体时，则应注意有些抗体只适合用于未固定冷冻组织。有时，抗原修复步骤则必不可少，这样可以消除由福尔马林固定所引起交联，因为有些抗体不能结合福尔马林固定和石蜡包埋组织中的靶目标。在数据表的应用章节会明确指出上述限制。2.3 样品种类尽管由于具有足够多的同源氨基酸序列，抗体可以和其它物种的同一靶蛋白反应，但是我们选择的抗体仍然应该是来源于同一物种的抗原刺激产生的。如果样品不是来自于列表所示的物种之一，也不能说明该抗体不可以用来检测这种样品，而可能是来自该物种的样品没被检测过，因此我们很难推荐它的适用性。根据序列相似性可以预测交叉反应性。2.4 选择一抗宿主的类别一般来说，当用标记二抗来检测非标记一抗时，产生一抗的宿主动物的类别就非常重要。对于免疫组化，产生一抗的宿主应尽可能的和样品的宿主种类不同，以避免二抗的免疫球蛋白与样品中内在的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。例如，用于检测鼠源蛋白的一抗就不应来源于鼠或大鼠，来源于兔则是比较适合的选择，接下来用检测分子（酶、荧光、生物素等）标记的抗兔IgG的二抗进行结合。如果有已标记的一抗则可以直接避免上述交叉反应发生。对于不含内源性免疫球蛋白样品的检测，宿主的种类选择不用很严格。例如进行western blotting的细胞裂解液就被认为不包含IgG。而组织溶解液和组织培养上清（包括血清）则被认为是含免疫球蛋白的。Western blotting时IgG会以50和25kDa的条带出现在降解和变性样品中，分别相当于IgG分子的重链和轻链。2.5 选择二抗二抗应来源于抗一抗的物种。举例来说，如果您的一抗来源于鼠，那么二抗就应该选择抗鼠的。我们建议仔细核对二抗数据表以确定您要使用的二抗。2.6 双重染色抗体的选择对细胞培养液或组织上清液进行双免疫染色要求非标记一抗来源于不同物种的动物，而二抗则特异性识别其中一种一抗。二抗如果与其他动物来源的免疫球蛋白有交叉吸附，则会在数据表中明确说明。2.7 荧光和染料标签标签结合在抗体上使抗体的结合可见。标签的选择依据以下几个方面：a.检测方法：荧光或有色沉淀。荧光标签会在特定波长的光激发下发光。根据它们自己激发和发光性质不同，有一些荧光标签是可用的。在结合了合适的底物时，酶标签HRP和AP可以形成有色沉淀。b.有效的封固剂（只限免疫组化）：AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色剂均溶于酒精，因此要求使用水溶性封固剂。以上提到的其他有机物要想得到较好的折射率，最好使用有机封固剂封固。荧光素标签需要水溶性封固剂。胆藻素蛋白（藻青蛋白/藻红蛋白）需要不加甘油的水溶性封固剂，否则会产生淬灭效应。c.生物素标记的抗体对于信号的放大是很有效的，比如可应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物（通常缩写为ABC试剂）或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法。3未纯化抗体的建议稀释和浓缩未纯化抗体在某一特定抗体浓度下会发生很显著的变化。如果不清楚给定的未纯化抗体样品的浓度，就可以参考下面的“特殊范围”作为估计的指导。相关阅读贝勒医学院博士B站直播问答合集
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