微囊藻毒素LR对淡水螯虾的组织病理影响 | 微生物专题

发表期刊：Science of the Total Environment

发表时间 ：2019

研究内容：微囊藻毒素LR对淡水螯虾肝胰腺转录组、肠道菌群及组织病理学的影响

影响因子：4.09

实验方法：16S rRNA基因测序+转录组测序

说到夏天的美食，想必大家都会想到小龙虾吧，蒜蓉，十三香，香辣，清蒸……哇~实在是美味！小龙虾也称克氏原螯虾、红螯虾和淡水螯虾，是我们生活中非常常见的一种甲壳类生物，这篇文章就是来研究微囊藻毒素LR对小龙虾的生命结构会造成哪些影响。

研究综述

过去几年，有害蓝藻水华的出现一直是世界各地的一个严重环境问题，主要由微囊藻和浮游生物产生，先前的研究发现，微囊藻毒素可诱发氧化应激、神经毒性、肝毒性、胃肠道疾病和肾脏损害，其中微囊藻毒素LR（MC-LR）就是最丰富的蓝藻毒素之一，因其毒性和丰度而受到广泛关注。已有研究发现MC-LR在蟹新螺颗粒肝胰腺中积聚，引起氧化应激；MC-LR可进入罗氏沼虾睾丸，损伤睾丸生殖细胞、细胞连接和线粒体，抑制睾丸发育等，但是对于MC-LR对甲壳动物肝胰腺转录组、肠道微生物群落和组织病理学的综合影响还需要进一步的研究，从而来揭示MC-LR的毒性。本文作者正式研究了这种微囊藻毒素MC-LR对小龙虾的肝胰腺、肠道菌群以及肠道组织的影响。

研究方法

在市场上随机取得大小相似的成年雄性小龙虾，在脱氯玻璃水中放置7天以上以适应实验条件，用纯度≥95%的MC-LR制备成250μg/mL的储备溶液，将小龙虾随机分为3组。每组3个重复，每个重复12只，将他们暴露于0、10和40μg/L的MC-LR中96h。然后随机抽取3个样本，冰上麻醉15min，取肝胰腺约300mg，立即液氮冷冻，观察MC-LR对转录组的影响，保存在-80℃提取RNA。此外，每组的小龙虾肠道和另外300mg肝胰腺组织被固定在多聚甲醛（4%）中以检查组织病理学。之后，随机抽取9份标本采集肠内容物。每个MC-LR处理组重复3次，每次重复3条肠合并在一起，以减少个体间变差异。取肠样本，用无菌PBS溶液冲洗3次。将肠道内容物收集在2mL无菌离心管中，立即冷冻在液氮中，并储存在-80℃以提取DNA。实验中所有采样均在超净工作台上进行。接下来就是RNA、、DNA分离、文库制备和测序。将测序得到的数据分别进行转录组组装与功能注释，表达基因（DEGs）的鉴定，定量RT-PCR分析，生物多样性分析，组织病理学检查等方法对数据进行一系列分析。

研究结果

图1 肝胰腺中DEGs的火山图

（A）10和（B）40μg/L MC-LR与对照组（0μg/L MC-LR）比较，红点代表上调基因，绿点代表下调基因。由图可见，在MC-LR培养液中的样上下调基因显著。

图2 KEGG富集图

经40μg/L MC-LR处理后的DEGs的KEGG富集，与空白对照比较。纵轴代表不同的路径，横轴代表富集因子。颜色对应不同的q值，点的大小表示差异基因的数量。

图3 KEGG通路图

红框中的酶与上调的DEG相关，绿框中的酶与下调的DEG相关。唯一显著富集的是半乳糖代谢途径。

图4 丰度柱状图

应用qRT-PCR技术对小龙虾肝胰腺RNA-seq基因表达模式的验证。M10:10μg/L MC-LR；M40:40μg/L MC-LR，图中可得MC-LR降低了螯虾肠道细菌的丰富度和多样性。

图5 丰度柱状图

不同MC-LR浓度下clarkii肠道优势微生物门（A）和属（B）的相对丰度。Con:0μg/L MC-LR；M10:10μg/L MCLR；M40:40μg/L MC-LR。图中看出MC-LR在门、属水平上显著改变了肠道微生物组成。

图6 显著差异分析图

不同MC-LR浓度在属水平下相对丰度变化显著性。*号表示差异显著（P<0.05）；**号表示差异显著（P<0.01）。Con:0μg/L MC-LR；M10:10μg/L MC-LR；M40:40μg/L MC-LR。

图7 肝胰腺和肠组织学的光显微照片

（A） 暴露于0μg/L M C-LR的肝胰腺；（B）暴露于10μg/L MC-LR的肝胰腺；（C）暴露于40μg/L MC-LR的肝胰腺；（D）暴露于0μg/L MC-LR的肠；（E）暴露于10μg/L MC-LR的肠；（F）暴露于40μg/L MC-LR的肠；L:管腔；E:上皮；Lp:固有层；Sm:粘膜下层；M:肌层。观察肾小管管腔扩张（黑色实心箭头）、空泡化（白色实心箭头）、嗜酸性颗粒细胞（黑色空心箭头）、异常肌层（椭圆形）和淋巴管细胞浸润（平行四边形）。H&E染色（100×）。上图可见，MC-LR对clarkii的肝胰腺和肠产生不良影响。

结论

微囊藻毒素(MC-LR)是一种肝毒素，对水生生物的危害极大。本研究研究了急性微囊藻毒素暴露对原螯虾肝胰腺转录组、肠道微生物群和组织病理学的影响。肝胰脏的RNA-seq分析鉴定了10μg/L和40μg/L的MC-LR处理后372和781个差异表达基因(DEGs)。其中免疫相关基因23个，氧化还原相关基因21个。

GO富集分析表明，MC-LR可以影响核转录mRNA的分解代谢过程、钴胺素和血红素相关过程以及四氢氯钴螯合酶的活性。此外，MC-LR诱导的KEGG通路中唯一显著富集的通路是半乳糖代谢通路。同时，对细菌16S rRNA基因测序显示，MC-LR降低了细菌丰富度和多样性，改变了肠道菌群组成。在门水平上，96 h后，10和40°g/L MC-LR处理组Verrucomicrobia丰度下降，而40°g/L MC-LR处理组壁厚菌门增加。在属水平上，15个属的丰度在MC-LR暴露后发生显著变化。我们的研究表明，MC-LR暴露可引起肝胰脏和肠结构损伤等组织学改变。这项研究为水生甲壳动物MC-LR毒性的机制提供了一个深入的认识。

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