为什么单细胞测序对细胞悬液活性要求那么高？ | 单细胞专题

10× Genomics 单细胞测序对单细胞悬液活性要求很高，在实际实验中，因为样本类型和单细胞悬液制备方法的不同，容易出现单细胞悬液中死亡细胞比例较高的情况。去除单细胞悬液中的死细胞和其他干扰对获得高质量数据至关重要，这是因为，死亡或破损的细胞中的 RNA 释放出来，这种 cell-free RNA 会导致数据结果中背景噪声升高，影响单细胞数据的质量。下面我们会举例说明高质量细胞悬液和死细胞去除对单细胞测序数据的影响。

10× Genomics 官方建议，当单细胞悬液活性低于 70% 时应做去除死细胞操作，并推荐使用 MACS® Dead Cell Removal Kit(Miltenyi Biotec) 试剂盒。需要注意到，去除死细胞的操作会损失一定的细胞数量，目前 10× Genomics 和 Miltenyi Biotec 都没有给出单细胞悬液含有多少细胞数量才建议做去除死细胞。基于我们的单细胞测序实验经验，建议单细胞悬液中的细胞数量不小于 30 万个时再做去除死细胞。

10× Genomics 公司做过一个测试实验，他们使用来自健康人的外周血单核细胞（PBMC）样本，然后将 PBMC 分成 4 组进行进一步处理。

1）Control：正常制备的 PBMC 样本；

2）24 h at RT：正常制备的 PBMC 样本室温下放置 24h；

3）Digitonin Low：使 用 5 ng/mL Digitonin 处 理 PBMC， 使 细 胞 悬 液 的 活细 胞<5%，并以 1:1 的比例与活性 >90% 的 PBMC 混合；

4）Digitonin High：使 用 5 ng/mL Digitonin 处 理 PBMC， 使 细 胞 悬 液 的 活细 胞<5%，并以 1:5 的比例与活性 >90% 的 PBMC 混合。

注：PBMC 在室温下长时间防止将导致死亡细胞增加。Digitonin 会透过细胞膜，模拟类似非活性细胞的表型。

为检测每个细胞组的细胞活性，用台盼蓝染色细胞并用细胞计数仪计算细胞数量（表1）。使用 MACS® Dead Cell Removal Kit(Miltenyi Biotec) 去除 4 个细胞组中的死细胞，

去除死细胞后，再次评估每个 PBMC 组的细胞活性（表 1）。

接下来，每个 PBMC 样本制备单细胞转录组测序文库（分别为去除死细胞处理前（Pre-DCR）和后（Post-DCR）），所有 8 个文库采用 PE 测序模式进行测序，测序数据量大约为 90,000 reads/cell，然后使用 Cell Ranger ™ 2.0 进行数据分析。

图 1 显示 8 份样本在死细胞去除前后的 Barcode Rank Plots，展示了 Barcode 数量（x 轴）与相应的总 UMI 数量（y 轴）的分布。绿色代表细胞，灰色代表背景。红色圆圈表示没绿色和灰色间没有出现陡降，黄色圆圈表示绿色和灰色间出现陡降，陡降表示代表细胞的绿色区域和代表背景的灰色区域具有良好的分离，良好的分离表明样本中存在少量的细胞外游离 RNA。游离 RNA 所占部分高通常是由于细胞活性偏低，破损细胞释放细胞内 RNA。Digitonin Low 和 Digitonin High 样本未经 Dead Cell Removal kit 处理前活性偏低（活性分别为 50% 和 20%）。分析结果显示细胞核背景缺乏良好的分离，表示这两个样本存在更多的背景干扰。

去除死细胞后样品清洁度增加

图 2a 和 2b 分别显示了各样本的 Fraction Reads in Cells（来自细胞的测序数据，此数据越高表示背景干扰越少）和 Estimated Number of Cells（捕获到的细胞数量）。用Digitonin 处理的样本在去除死细胞之前 Fraction Reads in Cells 最低 (~56-67%)，去除死细胞后，每个样本的 Fraction Reads in Cells 增加至 > 80%。

去除死细胞后增加了捕获细胞计数的准确性
本项测试每个样本设置的细胞捕获数为 1500 个细胞。图 1 中绿色线对应的 x 轴Barcode 数量即为 Estimated Number of Cells。从图 2b 可以看到，control 样本和做过去死细胞处理的样本，实际捕获细胞数与预计捕获细胞数（1500个细胞）十分接近，相比之下，室温放置 24h 或用 Digitonin 处理的样本的捕获细胞数量低于预期（24 h RT：1066 个细胞，Digitonin Low：278 个细胞，Digitonin High：730 个细胞）。
去除死细胞后增加了文库复杂性

图 3 显示了每个样本的 Median Genes per Cell（细胞检测到的基因中位数）（a）和 Total Genes Detected（总检测基因数）（b）。Median Genes per Cell 在所有样本中保持相对一致 (~1,000)，但 Digitonin High 样本除外。活性 20% 的 Digitonin High 样本Pre-DCR，细胞检测到的基因中位数仅为 27，但去除死细胞后文库的复杂度显著提高，基因的中位数提高到 >1000。有趣的是，室温放置 24 小时的样本显示了文库复杂度的降低，而进行去除死细胞处理仍无法恢复。

去除死细胞后大部分样本都能鉴定出主要细胞亚型
细胞聚类分析可以更直观地展示死细胞去除前后 8 个样本细胞聚类的变化，发现大多数样本的聚类结果相似，共获得了 14 个子聚类（图 5 至 8）。除了在室温下放置 24 小时的样本外，对照样本和另外两组去除死细胞后的样本可以清晰地鉴定出 PBMC 样本中的所有主要细胞亚型。在室温下放置 24 小时的 PBMC 样本中，表达 CD14 的单核细胞亚群几乎不存在（图 6）。此外，尽管在去除死细胞之后，室温下放置 24 小时的 PBMC 样本中鉴定出了所有其他主要的 PBMC 亚型，但亚型的聚类与其他样本不同。相反地，根据标记基因表达，在低质量（活性 < 50%）的样本中，出现亚群不存在或是亚群仅鉴定到几个细胞（图 7、8）。未能在细胞活性最低的样本中鉴定出任何主要的 PBMC 亚型（Digitonin High Pre-DCR，20% 活细胞）。

参考文献
1.https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample prep/doc/demonstratedprotocol-removal-of-dead-cells-from-single-cell suspensions-for-single-cell-rna-sequencing
2.https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample prep/doc/technical-noteremoval-of-dead-cells-from-single-cell-suspensions improves-performance-for-10x-genomics-singlecell-applications

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