单细胞测序不同组织线粒体基因表达情况 | 单细胞专题

|本文转载自公众号“生信交流平台”

近年来关于线粒体的研究虽然很多，但对科研人员来说它们仍然具有神秘色彩，是微妙小结构组成的细胞"发电站"。在本次分享中，我们将跟大家探讨线粒体的基本知识，以及在单细胞测序研究中线粒体的基因表达情况。

线粒体是细胞内最重要的细胞器之一， 它们对许多细胞过程是至关重要的，其中最突出的是能量的产生。另外，在程序性细胞死亡(凋亡)、细胞信号和代谢途径中也很重要。除了红细胞缺乏线粒体外，几乎所有细胞中都可以发现线粒体, 每个细胞内平均有300–400个线粒体，更活跃的细胞如大脑、肌肉、心脏、肝等有成百上千的线粒体，占细胞质的40%。

那么线粒体基因的表达都与哪些因素有关呢？

与组织类型相关：2018年发表在《Nature Communication》上的文章"The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes"对不同组织中的线粒体的表达情况进行了统计，发现不同的组织中的线粒体含量有着明显的差异，在心脏，肾脏，大脑等组织中线粒体基因表达比较量比较高[1]。

与细胞病理状态相关：很多研究发现肿瘤细胞中线粒体基因的表达总体上是上调的[2]。与正常人肝细胞株相比，在SMMC一7721细胞中，ND6、ATPase8、ATPase6等线粒体基因表达总体是增高的[3]；应用RT-PCR方法检测42例配对的胃癌和癌旁正常胃粘膜组织的线粒体编码基因ND4、ND5、Cyt-b和ATPase6的转录表达差异，结果显示胃癌组织线粒体COX I和ND4的转录水平显著高于远癌正常胃粘膜组织[4]；结肠癌癌前疾病家族性结肠息肉组织中ND116SrRNA的转录水平要比正常结肠粘膜高[5]，研究人员推测肿瘤细胞线粒体基因表达增强可能是对机体受外环境刺激的一种适应性反应。

与组织凋亡状态相关：线粒体不仅是动物细胞内的主要产能中心，在细胞凋亡中还承担着主开关的角色。作为细胞生死开关的线粒体，其通透性转变孔的开放，可让细胞色素、凋亡诱导因子等凋亡因子被释放到细胞质中，它们或激活凋亡蛋白家族的主要成员—胱冬肽酶，或独立地破坏核染色质，或作用于其他依赖性蛋白，使得细胞的整体结构破坏、功能紊乱，最终变成泡状凋亡小体而凋亡[6]。

现在小编为大家展示一下线粒体基因在不同组织的单细胞测序数据中的表达含量。

案例一

单细胞转录组测序揭示胰腺导管腺癌的肿瘤内异质性和恶性进展

研究背景：胰管腺癌(PDAC)是导致癌症死亡的主要原因之一，5年生存率仅为8%。虽然手术切除仍然是治疗的主要选择，但只有10%-15％的确诊患者满足条件，绝大多数患者最终会死于癌细胞的转移，其根本原因是由于缺乏改善患者预后的治疗方法。

研究目的：揭示PDAC肿瘤内异质性及PDAC进展的机制。

样本情况：原发性PDAC肿瘤(24例)和对照胰腺(11例)中57530个单细胞。

结论：文章鉴定了PDAC中多种恶性和基质细胞类型，包括两种异常和恶性基因表达谱的导管亚型。异质性恶性亚型是由几个具有分化、增殖和迁移潜能的亚群体组成的。

细胞轨迹分析显示，多个肿瘤相关通路和转录因子(TFs)在PDAC进展过程中均有不同程度的表达。一组具有独特增殖特征的导管细胞与肿瘤浸润性T细胞的失活状态有关，为预测抗肿瘤免疫反应提供了新的标记物。

图表解读：图中所示数据为百分比，以“正常1”为例，即在正常样本1中，58.97887%的细胞线粒体基因表达量超过5%；29.50044%的细胞线粒体基因表达量超过10%，以此类推。

文献引用：Peng, J., Sun, B.-F., Chen, C.-Y., Zhou, J.-Y., Chen, Y.-S., Chen, H., … Wu, W. (2019). Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research.IF=17.848

案例二

单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性

研究背景：肝细胞癌是肝硬化患者死亡的主要原因，而肝癌的分子发病机制非常复杂且具有分子异质性。癌症遗传的异质性不仅表现在不同患者之间，同一患者的不同肿瘤结节，甚至是同一个结节中也存在差异。肝细胞癌的分子异质性部分归因于肝癌干细胞的存在，被各种细胞表面标志物区分的不同癌症干细胞群体可能包含不同的癌症驱动基因。

研究目的：在单细胞水平对肝癌干细胞的异质性进行了全面分析，揭示了肝癌遗传异质性的重要原因。

样本情况：1例肝癌手术组织样本及2例肝癌细胞系样本。

结论：在单细胞水平上结合了肝癌的转录组和功能分析评估CSC异质性的程度，证明单细胞水平的肝细胞间充质干细胞具有表型、功能和转录功能异构,并且找到与HCC预后相关的基因。

文献引用：Zheng, H., Pomyen, Y., Hernandez, M. O., Li, C., Livak, F., Tang, W., … Wang, X. W. (2018). Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 68(1),127–140.IF=10.885

案例三

系统性硬化症相关肺间质疾病的成纤维细胞异质性和肌成纤维细胞

研究背景：肌成纤维细胞是系统性硬化相关间质性肺疾病(SSc-ILD)    细胞外基质重建的关键效应细胞。然而，在健康的和成纤维细胞肺中存在的成纤维细胞的多样性是未知的，这阻碍了肌成纤维细胞转录组的具体研究。

研究目的：识别和定义肌成纤维细胞和其他间充质细胞群的转录组，以了解成纤维细胞表型的改变是如何导致成纤维细胞纤维化的。

样本情况：4名健康对照和4名SSc-ILD患者的13例肺组织样本共56196个细胞。

结论：健康对照肺中有两个主要的成纤维细胞群，分别是SPINT2hi和MFAP5hi，以及一个次要的WIF1hi。对照和SSc-ILD间充质细胞的组合分析确定了SPINT2hi，MFAP5hi和少数WIF1hi成纤维细胞和大量新的成肌纤维细胞群，比较了所有SSc-ILD和对照间充质细胞群之间以及成纤维细胞亚群之间的差异基因表达，表明成肌纤维细胞在SSc-ILD中经历了最大的表型变化，并强烈上调了胶原蛋白和其他纤维化基因的表达。

文献引用：Valenzi E, Bulik M, Tabib T, et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myofibroblasts in systemic sclerosis-associated interstitial lung disease Annals of the Rheumatic Diseases 2019;78:1379-1387.IF=14.299

案例四

单细胞转录组分析揭示人类结直肠肿瘤的细胞异质性

研究背景：肿瘤内异质性是肿瘤治疗的主要障碍，也是肿瘤体积谱的重要混杂因素，结直肠癌作为一种常见的癌症，威胁人类健康。单细胞测序技术已运用于癌症研究的各个领域，目前虽然已经开发了多种算法通过聚类来推断细胞类型，但由于高水平的噪声和技术差异，其稳定性仍具有挑战性。

研究目的：通过结直肠癌不同细胞类型的研究，揭示细胞异质性，为结直肠癌临床研究提供理论依据。

样本情况：11名结肠癌患者肿瘤及癌旁组织1591个单细胞（全长转录组测序方法）。

结论：确定了两种不同亚型的癌症相关成纤维细胞(CAFs)。此外，上皮间质转化(EMT)相关基因仅在CAF肿瘤样本亚群中被发现上调，此外通过使用单细胞标记将结直肠癌患者划分为生存概率不同的亚组，并验证了不同分组与患者生存预后关系，对临床应用有重要意义。

注：此研究使用单细胞全长转录组测序

文献引用：Li, H., Courtois, E. T., Sengupta, D., Tan, Y., Chen, K. H., Goh, J. J. L., … Prabhakar, S. (2017). Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors. Nature Genetics, 49(5), 708–718. IF=25.455

案例五

对PBMC样本大规模单细胞转录分析

研究背景：了解生物系统需要了解它们各自的组成部分。单细胞转录组测序(scRNA-seq)可以用来分析在人口平均测量中被掩盖的转录组异质性。scRNA-seq的研究发现了新的细胞类型，并为开发过程中的调控网络提供了见解。然而，前面描述的scRNA-seq方法在扩展到数万个细胞或需要从有限的样本中捕获尽可能多的细胞时面临实际挑战。

研究目的：开发一种基于液滴的系统，能对每个样本中成千上万个单个细胞的3,端mRNA计数。

研究方法：使用29例样本，68kPBMC细胞验证该系统的敏感性和该系统对大量免疫细胞的识别能力。

结论：使用该技术可以得到大批的单细胞表达测量数据，有助于研究基因表达动力学和单个细胞类型的分子谱系。

文献引用：Zheng GX, Terry JM, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.Nat Commun.2017;8:14049. Published 2017 Jan 16.IF=11.878

上文中跟大家总结了不同样本类型的单细胞测序数据中线粒体基因的含量，可以看到不同样本类型线粒体基因含量有所区别，肿瘤细胞与正常细胞也不一致，从单细胞数据中验证了前文的结论，线粒体基因表达与组织类型，病理状态等相关。

参考文献

[1]Ferreira P G, Munozaguirre M, Reverter F, et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes[J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 490-490.

[2]李玉文, 刘青杰. 线粒体基因表达的影响因素及其在肿瘤细胞中的表达[J]. 癌变·畸变·突变, 2008, 20(6):490-492.

[3]王洁,王学敏,龙建纲,等.人肝癌 SMMC77 21细胞株部分线 粒体基因表达的研究[J].第二军医大学学报,2006,27(1):46-50

[4]韩璋波,李凡,毛晓韵,等.线粒体DNA转录表达与胃癌发生关系研究[J].中国肿瘤临床,2006,33(21):1205—1209．

[5]Yamamoto A，Horai S，Yuasa Y．Increased level of mitoehondrial gene expression in polyps of familial polyposis colipa tients[J] ．Cancer，1999，159(3):11 00—11

[6]高晋华, 王爱风. 线粒体与细胞凋亡[J]. 山西教育学院学报, 1999(04):32-34.

[7]Peng, J., Sun, B.-F., Chen, C.-Y., Zhou, J.-Y., Chen, Y.-S., Chen, H., … Wu, W. (2019). Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research.

[8]Zheng, H., Pomyen, Y., Hernandez, M. O., Li, C., Livak, F., Tang, W., … Wang, X. W. (2018). Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 68(1), 127–140.

[9]Valenzi E, Bulik M, Tabib T, et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myofibroblasts in systemic sclerosis-associated interstitial lung disease Annals of the Rheumatic Diseases 2019;78:1379-1387.

[10]Li, H., Courtois, E. T., Sengupta, D., Tan, Y., Chen, K. H., Goh, J. J. L., … Prabhakar, S. (2017). Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors. Nature Genetics, 49(5), 708–718.

[11]Zheng GX, Terry JM, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 2017;8:14049. Published 2017 Jan 16. 

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