你问我答：高通量测序相关问题微问答-20210118
从今天开始，原本属于联川生物内部技术支持针对客户群体的服务内容，即针对简单问题进行回答的服务，尝试性对所有关注本公众号的小伙伴们，试运行开放一段时间。
无论您是育种专家、动物科学研究人员还是基础医学和生物化学专业的研究人员，凡是与高通量测序及多组学分析有直接关系或间接关系的问题都可以发给我们。如单细胞测序、m6A、非编码RNA测序、宏基因组、蛋白代谢等涉及到样本准备、简单的实验设计、实验技术原理、生信分析等任何想得到的问题，都可以发送过来。
编辑好问题和内容，给我们market@lc-bio.com发送邮件，标题开头加入“微问答”即可。示例范文如下：
邮件标题：微问答：转录组结果与PCR验证相反怎么解释
邮件正文：联川的老师您好，请问我做了6个样本的转录组，每组3个生物学重复，挑选了10个差异较大的基因进行qPCR验证，发现吻合率只有20%，请问该如何解释？
好了，接下来开始进入我们的正题，微问答环节！
答：老师您好，原核转录组价格之所以比普通真核生物的转录组贵，其最根本原因在于富集mRNA的步骤，从原理上属于两套不同的技术体系。真核生物由于成熟的mRNA携带有多聚腺苷酸也就是polyA，我们可以使用带有TTTTTTT的磁珠也就是oligodT磁珠直接进行富集。而原核生物mRNA通畅不携带polyA，这就使得我们需要先使用细菌核糖体RNA（rRNA）探针+RNase H的方式去除掉这些rRNA后，才能进行建库。由于rRNA去除探针的成本本身较为昂贵，这才是两者成本上最大的区别。
当然更新的方法，针对低起始量的细菌RNA可以采用对所有RNA加polyA，然后反转录过程中加入rRNA封闭探针来阻止。
答：目前很少有同一个研究既用到了血清又用到了血浆，一般要不使用血浆要不使用血清。您之所以这么问肯定想要进一步了解，为啥要搜集血清或血浆，目的是为了解决什么问题。
1）第一维度——样本准备
从最浅层仅仅问题表面来看，搜集血清需要真空采血管采集外周血（也叫全血）。需要注意的是，加入EDTA等抗凝剂后从全血分离血浆，比血清其实就多了凝血因子。另外需要注意的是，血清样本外泌体有很多为红细胞产生的，可能后期对分析有干扰
联川生物推荐使用BD公司的PAXgene™采血管采集全血，使用BD公司的真空采血管采集全血后分离血清，或使用EDTA紫色抗凝管搜集全血样本以及分离后续的血浆样本。不允许使用绿色的肝素采血管采集全血，因为肝素会影响PCR酶的逆转录效率。
a. 血清样本采集方法
①建议使用进口医用血清管或真空采血管等收集全血
②上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置
③1800g 10min离心分离得到上层血清样本（全血需在1h内进行血清分离，依据血清管操作说明或客户实验室血清分离步骤进行操作）
④将血清转移至1.5mL离心管中，13000g离心2min；
⑤将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，每份样本至少≥100μL（0.1mL）。液氮速冻1h后-80℃保存，干冰运输
b. 血浆样本采集方法
①建议使用紫色EDTA抗凝管收集全血样本
②上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置
③1200g 10min离心分离得到上层血浆样本（全血需在1h内进行血浆分离，依据抗凝管操作说明或客户实验室血浆分离步骤进行操作）
④将血浆转移至1.5mL离心管中，13000 g离心2min
⑤将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，每份样本至少≥100μL（0.1mL）。液氮速冻1h后-80℃保存，干冰运输
假如样本存在细胞污染或轻微溶血现象。比如若出现轻微细胞或碎片混入可采用低速离心方式，如果已经采取方式仍然有核糖体RNA混入，则有大概率有轻微溶血现象，例如出现低渗溶液、机械性强力振荡、突然低温冷冻（-20℃～-25℃）或突然化冻、过酸或过碱等都有可能发生溶血现象。在使用注射器抽取全血时动作要快，而将注射器中的全血推到离心管中的速度不能过快，准备存放血样的EP管，可以事先用生理盐水进行浸润，这样可以减少血样刚刚接触EP管带来的红细胞破损。采集血标本时，试管倾斜约30度，使针头斜面靠近试管壁，避免血液直接射向管底，减轻血液的直接振荡。有时候加入抗凝剂后，需要混匀，原则上也是温柔的混匀。不要产生气泡！最后分离出的血清或血浆，可以使用A4纸作为背景观察颜色。祝老师下次实验顺利。
去除血清血浆或细胞上清液中的活细胞、死细胞和细胞碎片，先用300g-400g离心10min后取上清，去除活细胞。2000g离心10min，去除死细胞。10000g离心10min，去除细胞碎片。
2）第二维度——研究目的
这个维度通常在回答了血清和血浆样本如何准备后，要探究有什么研究目的。目前来讲，外泌体研究的话血浆样本更胜一筹，由于血清样本在全血分离的时候没有抗凝剂，红细胞可能本身会分泌一些外泌体对结果产生干扰。
另外就是血清血浆目前对仪器本身影响并不大，不是特殊需求，目前论文中无论是RNA还是蛋白代谢，基本上血浆样本和血清都有出现，没有特殊的需求。
3）第三维度——能讲哪些客户问题
只获得血浆或血清样本只是第一步，后续miRNA测序、lncRNA和circRNA研究以及蛋白等都需要大量用到血浆。目前看来血浆的比例大于血清。
答：有部分论文会对读者在微生物组测序方法产生一些困扰和错误信息。实际上微生物研究撇去三代测序等小众技术，以二代测序为主的技术中，扩增子测序和基于组装策略的宏基因组测序是两个主流方向。有少数论文会把扩增子测序方向的16s rDNA测序写成宏基因组测序。真正的标准做法是，16s rDNA、18s rDNA、ITS1、ITS2等属于扩增子测序，而大部分论文中metagenomics则真正属于狭义上的宏基因组测序。所以论文中实验部分是16s rDNA测序但是方法学写宏基因组测序是不对的。
答：m6A纯生信的文章这几年在低分杂志领域开始多起来了，而10分以上的高分文章除非真的很出彩否则很难发表一篇纯做生信分析的m6A论文。
目前纯m6A生信的文章不多，早些年主要是一些大佬们某个前言的科学问题以Resource的形式投稿，后来高分文章m6A纯生信更多 集中在数据库和软件算法开发方面，比较著名的就是中山大学的左志向、任间、骆观正，西交利物浦的孟家老师等。
所以m6A纯生信的文章目前陷入了跟ceRNA调控机制一样的怪圈。纯堆砌数据大多数集中在3-5分的杂志上。很多分析纯属讨论文和灌水文。
如果m6A纯生信想要出彩，算法上要革新外，还要分析出来的结论跟观点要为事实服务。
总的来说挺难的，还是老老实实去做实验吧！
答：每个细胞的total RNA=1-10pg也就是0.001-0.01ng。10的4次方也就是total RNA已经超过了1ng。这个时候，这些微量细胞由于起始量过于庞大，不可能直接使用smart预扩增裂解液，所以可以使用trizol提取完了RNA后直接进入smart-seq后续实验。因为————
①一般smart-seq取1-200个细胞，不用trizol用smart-seq专用的裂解液；②实验室这边的质控标准是，安捷伦2100的质检结果RIN值大于7.0，28S/18S值大于0.7，总量、浓度、纯度等达到要求；③有10的4次方那么多就直接加trizol然后寄送好了，细胞数太多了直接用预扩增裂解液效果不好。
答：跟上面的解释类似，1万个细胞total RNA总计才10-100ng。这种量常规转录组肯定不行，提取完了RNA直接做smart-seq。
答：外泌体中的RNA分子总量不多，如果用绝对定量miRNA测序，则会因为UMI标签聚类后有效miRNA分子降低。外泌体类样本直接做常规的miRNA测序项目即可。
一般血清或血浆2mL中外泌体，total RNA的起始量也就在10ng-100ng左右（不含大量rRNA序列信息）。这类样本需要特殊的miRNA建库方式。至于mRNA、lncRNA、circRNA等分析，建议不要做测序，使用安捷伦表达谱芯片平台即可。
答：常规建库的话，至少富集后的mRNA（被打断过）总量会在至少50ng左右。而细胞过少，则意味着需要大概率引入smart-seq的建库方法。通常<1000个细胞，毫无疑问用smart-seq建库方法。但是10000个细胞甚至更多的时候，提取RNA还是需要采取smart-seq的建库方法。
答：我猜测下您真实的需求是，在不开展后期RIP-seq前体下，可否看下已知的一些RNA结合蛋白（RBP）能够结合到哪些RNA分子，不管是数据库和软件只要有信息对不对？
那么这边可以推荐几个数据库供您参考。m6A2target专门搜集跟m6A相关的一些酶比如Writers、Readers相关蛋白有直接联系间接联系的下游RNA分子，非常适合m6A的下游机制研究。其他包括EuRBPDB、RBPDB、RBP2GO、CLIPdb等。
这边多啰嗦几句，这类信息或问题其实回答其他很难，因为问题只是表象，要在背后挖掘出核心需求才是最考验功力的。而如何提出一个好的问题在于是否聚焦是否能够让帮助你的人快速了解问题并1V1解决。
回答这个问题之前，联川的技术支持也在思考这个问题背后需要解决老师什么样的问题。因为涉及到RBP后的分子机制通常不会太浅，是想跟自己合作做一次双验证还是想在开展自己实验前看下其他研究结果，亦或是没钱想在论文里凑内容，都是后期需要提问人对问题进行二次加工。
答：可以。肺泡灌洗液通常需要4mL-5mL左右，无论是人还是大小鼠等。在伦理允许下，灌洗液500g在4℃下离心10min搜集沉淀重悬计数，即可上机。如果不放心，可以加入一些细胞培养基如1640（或者DMEM）里面加入10%FBS后0-4℃寄送，24h内活性计数后上机。
答：目前10X官方无任何信息证明Visum可以开展BCR和TCR测序，所以这个需求暂时无法满足。
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