植物单细胞核测序-让植物scRNA-seq不再受困于原生质体制备 | 单细胞专题
虽然近年来利用原生质体分离技术(PI, protoplast isolation)进行植物单细胞转录组测序的研究已经有了较大进展，但与哺乳动物组织和细胞相比，植物组织和植物细胞开展单细胞测序仍具有更高的挑战：
1、 植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；
2、 植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；
3、 植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大）；
4、 质体细胞器、和液泡中存在可与RNA相互作用的次级代谢物；
5、 不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；
6、 制备的原生质体很脆弱，活性波动大。
文章题目：Single-nuclei RNA-sequencing of plants
发表单位：德国柏林洪堡大学、马克斯·德尔布鲁克分子医学中心/柏林健康研究所
物种材料：拟南芥(Col-0)幼苗及花序（10个）、矮牵牛未开放芽（10个）、大黄草未开放芽（8个）、番茄茄完全发育的花（20个）和叶片（1.3 g）
技术手段：Bulk RNA-seq、snRNA-seq
抽核方法
1、 冷冻组织用研钵和杵在液氮中小心地压碎成小块，然后转移到装满5mL Honda缓冲液（2.5 % Ficoll 400, 5 % Dextran T40, 0.4 M sucrose, 10 mM MgCl2, 1μM DTT, 0.5% Triton X-100, 1 tablet/50 ml cOmplete Protease Inhibitor Cocktail, 0.4 U/μl RiboLock, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4）的gentleMACS M管中；
2、 M管放入gentleMACS解离仪并按照专用程序在4°C下运行以破坏组织并释放细胞核；
3、 将得到的悬浮液用70μm的过滤器过滤，在4℃下1000g离心6分钟；
4、 沉淀重悬于500μl Honda缓冲液中，使用35μm过滤器过滤，并用3x染色buffer染色 (12μM DAPI, 0.4 U/μl Ambion RNase Inhibitor,0.2 U/μl SUPERaseIn RNase Inhibitor in PBS)；
5、 使用BD FACS Aria III在DAPI峰(200000-400000 events)设门并分选细胞核，核分选到小体积landing buffer (4% BSA in PBS, 2 U/μl Ambion RNase Inhibitor, 1 U/μl SUPERaseIn RNase Inhibitor)；
6、 分选后的细胞核使用NucBlue(Invitrogen Ready Probes Cell Viability Imaging Kit (Blue/Red))染色后显微检测完整性（Neubauer）；
7、 取一部分分选后的细胞核提取RNA并使用Agilent’s Bioanalyser 2100质检评估RNA质量
结果
1、 单细胞测序前原生质体制备引入的问题
首先在分析Denyer et al单细胞数据前进行了独立的bulk RNA-seq实验来识别原生质体分离（protoplast isolation，PI）应答基因，然后将它们从scRNA-seq分析中剔除。发现无论剔除PI应答基因前后，PI诱导的影响均存在（图1）。
图1：a和b分别代表PI诱导基因剔除前后聚类结果，中间UMAP图表示细胞与PI和non-PI样本转录组相关性，数字表明细胞与PI样本的转录组具有更强的相似性。
2、 分离和scRNA-seq文库的制备
以上结果突出了开发针对植物单细胞组学的替代方法的需要，此外，原生质体分离在某些植物组织中也不可行，因此本研究提出了植物单细胞核转录组测序策略（PN-seq）。关键步骤包括：用杵将速冻的拟南芥组织轻轻物理分离，转移到Honda缓冲液中进行细胞裂解。使用美天旎解离仪器机械破坏细胞壁和细胞膜，DAPI染色观察细胞核是否完整，FACS分选区分核与碎片，Takara ICELL8系统生成高质量cDNA文库（图2）。同时为了证明该方法对不同植物物种/组织的适用性，研究人员成功地在拟南芥(幼苗和花)、矮牵牛(花)、猪尾草(花)和番茄茄(花和叶)中进行了核分离。
图2：PN-seq流程
3、 PN-seq性能
以拟南芥幼苗为材料开展PN-seq，3次试验重复中，每个重复平均捕获到1116个细胞核，测序深度在220,000 reads/核时检测到的基因数为2802，重复之间相关性达到0.9，PN-seq和Bulk-seq之间相关性达到0.74（图3d），与已报道的数据一致。
细胞聚类获得13个clusters，包含了幼苗主要基本器官类型：叶/子叶(643个核)，下胚轴(393个核)，脉管系统(叶/根)(342个核)，根(267个核，2个clusters)，茎分生组织(180个核)，根尖(192个核，2个clusters)，根/下胚轴(136个核)，叶(152个核，2个clusters)和成熟根(27个核)（图3b）。3个重复中观察到每个注释簇的细胞核比例相似，再次表明该方法具有良好的重现性（图3c）。
图3
4、 植物固定材料和非固定材料间PN-seq相似性比较
考虑到PN-seq中更多的技术灵活性，即简化植物样品存储和维持原位表达状态的可能性，使用收获后直接甲醇固定幼苗开展PN-seq，发现甲醇固定样本捕获到的细胞核数(850个)和平均表达基因数(2292个)与未固定样本(1116个细胞核和2802个基因)类似，固定样本之间的聚类结果也类似(图4a），固定与未固定样本相关性达到0.88（图4b、c）。这些结果表明，材料的固定不会引起细胞核数目和获得的细胞类型产生差异。
5、 拟南芥花序PN-seq
为了评估PN-seq在研究细胞分化方面的性能，将PN-seq应用于拟南芥开花前花发育的所有阶段。共获得了856个核，平均每个核有2,967个表达基因，聚类得到15个对应不同器官和发育阶段的clusters（5a）。鉴定到每个cluster的特异性marker基因后，绘制这些基因在TraVaDB数据库不同花器官和发育阶段的表达谱（图5b）。clusters 3, 4, 6, 7, 10, 15被鉴定为花发育过程中不同阶段的花药，PN-seq检测到了从未分化的干细胞（cluster 0）到分化终末状态细胞（cluster 3）的基因表达变化（图5c）。将每个花药簇细胞的平均伪时间与TraVaDB注释得到的每个花药簇的发育时间绘制在一起，发现分析得到的发育时间与数据库花药发育阶段具有较强的一致性，表明可以用估计的每个细胞的假性时间作为花药发育阶段的指标，从而研究花药分化的转录动力学。
使用GENIE3说明利用snRNA-seq数据推断植物发育过程中基因调控网络(GRNs)动态的能力，重建了所有被鉴定为花药cluster的GRNs，并估算了已知转录因子(TFs)与所有表达基因之间的相互作用强度。图5d为早期花药阶段（cluster 15）GRNs结果，一个主要的TF(具有最多的相互作用)是AMS（如5c），一种已知的花药发育调节因子，AMS靶基因在发育早期主要参与染色质重塑，发育晚期靶基因主要是代谢酶以及与RNA调控过程相关的基因（图5e）。
图5
6、 Marker基因验证
为了验证聚类和动态花药转录组轨迹结果，使用启动子::NLS-GFP报告系评估基因的表达模式。选择了10个先前未鉴定的基因，然后基于PN-seq数据预测它们会在某个cluster中特异性或优先表达，验证结果发现10个被选择的基因中有7个表现出与预测一致的特定表达（图6）。
图6
结论
以上数据体现了植物单细胞核测序的技术性能，与单细胞测序相比，细胞核测序在得到高质量数据的同时也让研究者不再受困于原生质体制备，能够推动植物单细胞研究。
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