技术贴：转录组建库如何去除total RNA中rRNA等高丰度RNA

转录组测序已成为转录组信息研究、发现新转录本、新的可变性剪切的重要手段。但对于绝大部分生物体，我们提取得到的总RNA中含有大量核糖体RNA（rRNA），如进行文库构建时不去除核糖体rRNA或其他高丰度RNA（如血液总RNA样本中的免疫球蛋白mRNA），则测序得到大量“无用”数据，大大增加测序成本，同时增加发现低丰度转录本的难度，非常不利于转录组序列的研究。

初始的转录组建库方式，一般采用带有oligo dT的磁珠对总RNA样本中的poly A RNA进行富集后建库，这种方法存在几种缺点：1、只能运用于真核生物，对于mRNA不带poly A RNA的原核生物则无法使用。2、对RNA完整性要求比较高，因降解造成的poly A 尾断裂的mRNA则无法被富集。3、无法富集不带poly A 尾的lnc RNA，circRNA。4、无法去除血液样本中高丰度的免疫球蛋白mRNA。

因此，对于原核转录组，宏转录组，以及需要研究lnc RNA，circRNA等方面的研究，需要的是进行rRNA等高丰度RNA的去除，再进行建库。

01探针杂交+链霉亲和素磁珠去除法

该方法的原理为：

1、采用生物素标记的DNA探针（与需要去除的RNA可互补杂交）与总RNA中高丰度 的rRNA以及免疫球蛋白RNA液相杂交，形成RNA-DNA探针(生物素基团标记)复合物。

2、采用链霉亲和素标记的磁珠，结合液相中的RNA-DNA探针(生物素基团标记)复合物和多余探针。

3、分离磁珠和液相，液相上清中剩余的RNA即为去除rRNA等探针针对的高丰度转录本后的RNA，通过沉淀等方式可回收后进行后续测序文库构建。

该方法虽然能有效去除探针针对的rRNA等高丰度RNA，同时也可针对降解样本，但是存在一下缺陷：

1、成本较高。2、操作复杂，影响实验通量。3、物种限制性，需要针对不同物种设计不同探针，虽然某些近缘物种可采用同一套探针，但是去除效果往往有差异，且对物种构成比较复杂的样本（如环境样本等）则无法进行实验。

02探针杂交+RNA酶H消化法

RNAse H是一种可针对性的消化RNA/DNA杂合链上RNA单链的酶，针对这种酶的活性特点，开发出了探针杂交+RNA酶H消化去除总RNA样本中的rRNA等高丰度RNA的方法。

该方法原理为：

1、采用过量的DNA探针（与需要去除的RNA可互补杂交）与总RNA中高丰度 的rRNA以及免疫球蛋白RNA液相杂交，形成RNA-DNA探针复合物。

2、RNAse H针对性的消化RNA-DNA探针复合物上的RNA单链，而未与探针杂交的mRNA，lncRNA等不受影响。

3、采用DNAse 消化剩余的探针。

4、纯化回收未被消化的RNA，可用于后续建库。

与探针杂交+链霉亲和素磁珠去除法相比，探针杂交+RNA酶H消化法效果与其相似，且有成本相对较低，操作相对简单等优点。但是，相同的，也存在物种限制性，必须针对不同物种设计不同探针，大大限制了该方法的应用范围。

03双链特异性核酸酶消化法

Duplex-specific nuclease（双链特异性核酸：DSN）是来源于堪察加半岛红王蟹（RedKingCrab）肝胰腺的一种核酸酶，能特异性的消化双链DNA以及DNA-RNA杂合链，其消化特点是会优先消化反应体系中拷贝数占据优势的核酸，这种特征可用于将总RNA中占绝对优势的核糖体rRNA或其他高丰度RNA拷贝量大大降低，从而大大去除目的。

该方法的原理为：

1、以随机引物逆转录片段化的总RNA，形成RNA-cDNA杂合链。

2、以DNS处理逆转录产物，将其中拷贝量占绝对优势的rRNA或其他高丰度RNA形成的绝大部分杂合链消化。

3、剩余的杂合链进行二链合成，构建测序文库。

相对于前述两种需要探针的方法，该方法没有物种限制，对非模式或罕见物种样本，复杂来源样本，环境样本等，均可以使用，大大拓展了转录组（lnc，circ）测序的应用范围。不足在于，rRNA去除的效果在不同的物种中有所不同，另外对于其他高丰度RNA也有一定的去除效果，会造成定量的偏差，但研究表明这种偏差一般在10%之内。

作者简介

梁洪，联川生物资深实验员，现为研发部PCR高级研发工程师，在基因芯片和高通量测序领域拥有超过13年的工作经验，熟练掌握多种芯片平台（安捷伦表达谱芯片、昂飞表达谱芯片、联川微流控小RNA芯片等）的操作方法，并对各自性能优劣有着充分对比。2008年开始，为国内第一批接触高通量测序的”资深玩家“。梁洪根据自身多年生产经验，申请了一系列芯片与测序的相关生产工艺改良专利，在公司内部被诸多后浪们尊称为梁哥，擅长解决各种芯片和测序的相关问题。

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