于君组Gastroenterology揭示CRC瘤内微生物异质性 | 肿瘤微生物
大量研究表明肠道微生物群落与肿瘤存在密切的关系，在一定程度上瘤内微生物决定着肿瘤的发展。对于微生物与癌症的具体关系，目前公认的是，饮食模式和生活方式与结直肠癌风险的增加有关，而这些外在因素和宿主遗传背景可以通过改变微生物群落的组成和功能而很容易地影响微生物群落，这种改变可能导致生物失调和结直肠癌的发展。以下研究具体带来了通过瘤内微生物的异质性的研究，发现了微生物与腺癌演变顺序发展之间的关系。
发表期刊：Gastroenterology
发表时间：2021影响因子：19.233
研究内容：16S rRNA基因测序研究结直肠癌组织内微生物多样性
本文图解摘要
考虑到人类肠道微生物谱在很大程度上受到不同地理区域的影响，这是由于人群之间的外部因素(如生活方式和饮食摄入量)的差异导致的，因此在样本入组时建立了两个队列，以排除地理异质性的影响。最终从中国南方和北方两个地理位置不同的医院的受试者身上收集了266例组织活检样本(每个患者4-6例来自结直肠肿瘤的活检，2份来自邻近正常组织的活检)。队列1由11例CRC和10例腺瘤患者组成；队列2由10例CRC和10例腺瘤患者组成。此外，从15例CRC和12例腺瘤患者中收集了57例肿瘤活检样本和113例邻近正常组织活检样本。总计收集了436例来自CRC(n=36)或腺瘤(n=32)患者的组织活检样本。
首先通过生物群落的整体表型模式研究发现在两个队列中结直肠癌组织的α多样性(Chao1和Shannon指数)均低于腺瘤组织（图1A）。结直肠癌和腺瘤组织的β-多样性在两组中也有显著差异(P<0.01，PERMANOVA；图1B)。然而，肿瘤和相应的邻近正常组织之间的微生物多样性(α和β多样性)的差异并不显著(图1A和B)。
为了评估结直肠癌和腺瘤之间差异的原因，作者在三个不同的水平上进行了分析：微生物群落，微生物相互作用和微生物本身。首先，无监督的NMDS分析和PERMANOVA表明，疾病状况(结直肠癌或腺瘤)对两组人群中微生物谱的差异有显著影响。其次，结直肠癌相关微生物之间的相关性在结直肠癌中比在腺瘤中更具有共斥性。最后，Fusobacterium（梭杆菌），Bacteroides（拟杆菌），Parvimonas（微单胞菌），Prevotella（普氏菌）等与结直肠癌相关菌属以及益生菌属的丰度在结直肠癌和腺瘤活检之间有显著差异。同时，在队列1和队列2中观察到这些选定的微生物群在疾病进展中的丰度变化相似，从而排除了地理异质性的影响。所有41名患者的每个活检组织中的细菌在门水平上的组成分布显示(图1C），大多数结直肠癌患者梭菌丰度(平均5.36%)高于腺瘤患者(平均0.11%)。结直肠癌患者微生物群以厚壁菌门为主，变形菌门其次；腺瘤患者以变形菌门为主，厚壁菌门其次。
02 结直肠肿瘤中的异质微生物群落
接下来为了探究结直肠肿瘤内的微生物群落是否是异质性的，取单个肿瘤的不同区域以及邻近正常组织的多个活组织标本来进行比较分析。代表性属的选择基于3个标准(NA（标准化丰度）≥1，在肿瘤中的相对丰度≥0.1%，以及%CV（百分比变异系数）≥50）。结果发现，与同一结直肠癌患者的其他肿瘤活检组织相比，每个肿瘤活检组织都有自己的微生物群落组成。这一观察结果在队列1(图 2A)和2中的所有结直肠癌患者中都得到了证实。肿瘤内的微生物群落被观察到是异质性的，典型的是结直肠癌患者1的图谱（图2B）。网络图谱分析显示肿瘤内特定部位的微生物富集(图2C)。类似地，所有腺瘤患者的肿瘤活检组织的微生物区系组成都有显著不同。在同一部位采集的活检组织中，微生物丰度的变化明显低于从不同肿瘤部位采集的标本。因此，结果提供了在单个结直肠癌或非恶性腺瘤中存在微生物异质性的证据。
为了检验瘤内微生物的异质性与结直肠癌的发生是否存在相关性，选择了丰度变异较大(%CV>50)的微生物进行后续分析，并将其命名为高可变微生物(HVMs)。在两个队列的结直肠癌组织和腺瘤组织中，共鉴定出156个HVM和203个HVM(图3A)。其中腺瘤的21例HVM数高于结直肠癌(P<0.05；图3B)，提示瘤内HVM可能沿腺癌演变顺序减少。
通过将与肿瘤状态相关的具有相似瘤内变异的微生物分组，建立了五个meta-community（集合群落）(图3C)。特别的，队列1集合群落c1-1主要由结直肠癌的HVM组成，大部分属于厚壁菌门；队列1集合群落1-2主要由腺瘤的HVM组成，以变形杆菌为主；队列集合群落c1-3同时由结直肠癌和腺瘤的HVM组成。通过对队列1和队列2的HVM研究结果进行比较发现，c1-1和c2-1之间的HVMs相似性为40%，c1-3和c2-3之间的相似性为63%，表明在22个腺癌演变顺序中发生了微生物群落的改变。最后对结直肠癌和腺瘤患者邻近正常组织HVM进行检测发现，78%的结直肠癌组织和88%的腺瘤组织中未观察到相关HVM。表明在结直肠癌进展过程中，非肿瘤组织中结直肠癌/腺瘤相关微生物的丰度变化不明显。
基于观察到的现象，推测在结直肠癌的发生过程中，每种HVM在肿瘤内的丰度变化可能是不同的。微生物丰度的变化沿腺癌演变顺序变化显示（图4A）：某些富集于结直肠癌特定瘤内区域的微生物在腺癌演变顺序上的丰度变化增加。而其他一些富集于腺瘤特定区域的微生物，其丰度随腺瘤-癌的变化呈递减趋势。为了确定单个HVM和CRC进展之间的关联，选择了来自CRC相关集合群落的HVM。通过比较结直肠癌和腺瘤中HVM的丰度变化，计算出每个HVM的FDV。如果FDV>1，这意味着这种HVM在瘤内的丰度从腺瘤上升到癌(称为方差增高型HVM)，而FDV<1的HVM称为方差减少型HVM。方差增大的HVM总数(n=19)略高于方差减小的HVM(n=16；图4B)。总体而言，结果显示，瘤内单个微生物丰度的变化可以沿腺癌演变顺序改变。
图 4 腺瘤-癌演变顺序中HVMs变异的变化
在所有组织活检中平行进行KRAS突变和MSI检测。使用零膨胀对数正态模型计算了有和没有KRAS突变(KRAS阳性：n=14)的结直肠癌组织中微生物的差异平均丰度(DMA)。RI分类器能显著区分结直肠癌组织中的微生物群落(P<0.001，双尾Mann-Whitney U检验；图5A)。共有26种微生物与KRAS突变显著相关(受试者工作特征曲线下面积(AUROC)=0.90；图5B)，拟杆菌属是与KRAS突变呈正相关的最重要的属(dma=0.1218)(图5C1)。对于腺瘤，与结直肠癌的研究结果一致，RI分类器将存在和不存在KRAS突变的腺瘤组织中的微生物群落显著分开。共有14种微生物，包括Peptostreptococcus（消化链球菌）(DMA=0.0157)和Clostridium（梭状芽孢杆菌）(DMA=0.0110)与KRAS突变显著相关(AUROC=0.83)。同样地，结直肠癌组织中的微生物群落显著分离(P<0.001，双尾Mann-Whitney U检验；图5A)，38种微生物与25MSI有很强的相关性(AUROC=0.9；图5B)。总体而言，在宿主基因改变的组织中存在明显的瘤内微生物群落。
接下来为了研究突变情况与肿瘤内异质微生物区系之间是否存在相关性。KRAS基因突变阳性的结直肠癌患者的细菌图谱显示，肿瘤内微生物群组成多样(图6A-B)。根据MSI阳性肿瘤活检的大肠癌患者的细菌图谱，肿瘤内异质微生物群落也被确定(图7A-B)。就单个微生物而言，26种与KRAS相关的微生物中有22种(85%)被鉴定为HVM，38种与MSI相关的微生物中有28种(74%)被确认为HVM(图5D)。这些发现共同表明，超过70%的突变相关微生物在肿瘤内的丰度有很大的变化。
图 5 肿瘤内微生物群落与宿主基因突变的相关性
图 6 KRAS基因突变阳性CRC患者的细菌图谱分析
图 7 MSI阳性CRC癌患者的细菌图谱分析
编者说
本文主要通过16S测序分析揭示了结直肠癌与瘤内微生物群关系。从实验设计到结果辅助验证，均进行了严密的讨论说明，向我们一步步介绍了微生物群与结直肠癌发生过程的变化关系。其中很多方法具有借鉴意义，包括样本入组标准，差异菌群的进一步筛选标准；围绕菌群之间关系以及菌群与疾病状态关系，进一步通过KRAS突变和微卫星不稳定性相关分析呈现出结直肠癌发生与微生物群的关系。
如您对“肿瘤组织微生物组”研究感兴趣，欢迎咨询与交流。
参考文献
Liu W, Zhang X, Xu H, et al. Microbial Community Heterogeneity Within Colorectal Neoplasia and its Correlation With Colorectal Carcinogenesis. Gastroenterology. 2021 Feb 11:S0016-5085(21)00407-8.
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