文献解读：microRNA直接介导增强线粒体基因翻译，影响肌肉细胞分化 | miRNA专题

众所周知，动物体内的microRNA可介导细胞质中的翻译抑制和mRNA降解。而除细胞质外，在膜结合细胞器中也检测到了各种microRNA，但其功能意义仍然难以捉摸。本文研究针对线粒体中的miRNA，发现了增强线粒体翻译的miR-1，是生肌过程特异性诱导的miRNA，可有效进入线粒体，并刺激线粒体基因组编码的转录本翻译。

增加线粒体翻译有两个条件：①miRNA与mRNA特异性碱基配对；②Ago2蛋白，但不需要其功能结构GW182。

本文研究通过CLIP-seq技术得到的相关发现：①Ago2蛋白在线粒体翻译中有积极作用；②线粒体靶向的Ago2蛋白具有功能性抢救作用；③细胞质中的microRNA机制出现选择性抑制。

本文研究的发现揭示了microRNA在线粒体翻译中的积极作用，以及通过miR-1介导的线粒体翻译刺激和细胞质翻译抑制作用促使肌肉分化过程进行。

1.背景介绍

线粒体，一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，直径在0.5到1.0微米左右，是细胞中制造能量的结构。是有氧呼吸的第二、三阶段、三羧酸循环和氧化磷酸化的场所，线粒体由外至内可划分为线粒体外膜、线粒体膜间隙、线粒体内膜和线粒体基质四个功能区。线粒体基质中一般还含有线粒体DNA、RNA和线粒体核糖体。

miRNA，由细胞内源产生的发卡（hairpin）结构转录本加工而来的单链小RNA。miRNA在RNA诱导的沉默复合物（RISC）的作用下通过碱基配对结合其靶点mRNA，可以发挥其基因表达调控作用。RNA诱导的沉默复合物（RISC）核心组件，Ago蛋白和Ago结合蛋白GW182。GW182通过N端的GW结构域结合Ago蛋白，而C端的沉默结构域形成很大的平台以招募其他辅助蛋白。动物体内，miRNA作用机制多样化，有转录抑制、对mRNA的降解与对mRNA的切割。其中对mRNA的切割由具有切割能力的Ago蛋白（在哺乳动物中为Ago2蛋白）完成。

miRNA机制主要在细胞质中起作用，而有其他研究表明，在膜结合细胞器中，例如分泌的囊泡和线粒体，也已检测到miRNA。本研究原本意在解决一个难题，在肌肉分化过程中线粒体DNA（mtDNA）编码的蛋白显著升高，但是mtDNA拷贝数或转录本并没有显着增加。在解决难题过程中，意外发现了肌肉特异性miR-1能够刺激线粒体多种mtDNA编码的转录本翻译，同时在细胞质中抑制其细胞核DNA编码的转录本，从而展开了进一步的深入研究。

2.实验结果

1. 肌肉分化过程，线粒体蛋白合成显著增加

图1 线粒体蛋白增加，但线粒体DNA拷贝数或转录水平并未显著升高

(A) Western blotting检测不同成年小鼠组织中COX1和ND1蛋白水平，Northern blotting检测miR-1蛋白水平。组蛋白H3和5S rRNA分别作为实验内参。

(B) C2C12细胞分化前后COX1、ND1和miR-1的Western和TaqMan PCR分析，Panactin和VDAC作为蛋白质内参，28S rRNA作为RNA内参。MHC蛋白作为诱导肌肉分化的标志。Tfam和TACO1作为线粒体转录和翻译关键调节因子。

(C) 在C2C12细胞分化过程中，COX1和ND1蛋白的表达量变化。

(D) 在C2C12细胞分化过程中，线粒体DNA拷贝数变化。

(E) 在C2C12细胞分化过程中，COX1和ND1的转录本拷贝数与内参基因GAPDH转录本比值变化。

① 在肌肉组织（如骨骼肌和心脏）中，相对于不同小鼠组织中表达恒定的核DNA编码的组蛋白H3蛋白和5S rRNA，线粒体编码蛋白表达高，miR-1表达高；在肌肉细胞中检测到显著表达的mtDNA编码蛋白ND1、COX1；

② C2C12细胞分化过程，线粒体编码蛋白ND1、COX1表达高，诱导MHC和miR-1表达；转录激活因子Tfam表达无显著差异；

③ C2C12细胞分化过程，线粒体编码蛋白ND1、COX1表达升高了15倍以上；

④ C2C12细胞分化过程，线粒体DNA拷贝数无显著增加；

⑤ C2C12细胞分化过程，ND1、COX1的mRNA水平无显著升高。

2. 线粒体中存在Ago2蛋白

图2线粒体中Ago2蛋白和miR-1的检测

(A) 对来自成年小鼠心脏、C2C12成肌细胞和C2C12肌管的纯化线粒体(MT)和无外膜线粒体进行胰蛋白酶保护分析。

补充材料图：线粒体中Ago蛋白的检测

① 纯化的线粒体(MT)及无外膜线粒体(MP)中无内质网特异性蛋白ERp60和ERp72，提取中无内质网污染；

② MP中无外膜标记蛋白Tom20，表明线粒体外膜去除彻底；

③ MP中检测到内膜标记蛋白NDUFB8和线粒体基质蛋白HSP60，表明MP内膜完整；

④ C2C12细胞分化过程，在提取的的MT和MP中都检测到Ago2蛋白，只有当内膜进一步用Triton X-100渗透时，才对胰蛋白酶敏感；

⑤ C2C12细胞分化过程，在MT和MP中Ago1蛋白与Ago3蛋白未被检测到，表明Ago2可能被选择性导入线粒体。

3. C2C12细胞分化过程，线粒体中Ago2蛋白与miR-1的定量

图2线粒体中Ago2蛋白和miR-1的检测

（B）成肌细胞及肌管的每个C2C12细胞核或每个线粒体基因组的Ago2蛋白和miR-1的定量。

① 成肌细胞分化为肌管，肌管为多核，成肌细胞每个核基因组对应的Ago2蛋白分子数为1.34×10⁵个，肌管每个核基因组对应的Ago2蛋白分子数为1.34×10⁵个；

② C2C12细胞分化前和分化后，每个线粒体基因组对应的Ago2分子数分别为31和314；

③ 成肌细胞中线粒体比核DNA的比例为554，肌管中线粒体比核DNA的比例为774，C2C12细胞分化前线粒体中Ago蛋白分子占比为31×554 / 1.34×10⁵= 12.8％，C2C12细胞分化后线粒体中Ago蛋白分子占比为314×774 / 7.35×10⁵= 33.1％；

④ 肌管中每个核基因组对应的miR-1分子数为5.9×10⁴个，每个线粒体基因组对应的miR-1分子数为31.5，线粒体比核DNA的比例为775，线粒体中miR-1分子占比为31.5×775 / 5.9×10⁴ = 41.4%；成肌细胞中未检出miR-1；因此，Ago2蛋白，miR-1不仅大量存在于线粒体中，而且在肌肉细胞分化过程中也呈现增加而不是减少。

4. 诱导的miR-1有效进入肌肉细胞线粒体

图2线粒体中Ago2蛋白和miR-1的检测

(C)核酸酶保护分析。MT和MP用缓冲液、RNaseT1 (RN) + MNase (MN)、Triton X-100是否存在等条件进行核酸酶组合处理。

(D)同一细胞群分离得到的缺乏内质网标记物ERp72的MT和MP，其中MT中存在外膜蛋白标记Tom20，MT和MP中均存在内膜蛋白标记NDUFB8(下图)。用半定量RT-PCR分析用空白对照、抗Ago2抗体或抗IgG抗体处理的MT和MP中ago2相关线粒体转录本(上图)。

补充材料：用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测MP中的ago2相关线粒体转录本。

① 对MP中的miR-1进行定量，发现在肌管的线粒体内可检测到一部分新诱导的miR-1，且仅在存在Triton X-100的情况下，才对核酸酶敏感；

② 用抗Ago2抗体捕获线粒体转录本，再进行RT-PCR定量分析，结果显示可捕获多个与Ago2蛋白相关的线粒体转录本；

③ RT-PCR定量分析结果表明，线粒体转录本拷贝数IP组比input组比值显著上调；

④ miRNA机制在分化的C2C12细胞的线粒体中呈现增加而不是减少。

5. miRACE、CLIP-seq鉴定出多个miRNA靶点

补充材料：miRACE实验，鉴定miRNA特异性的靶点。

图3通过CLIP-seq绘制Ago2- RNA相互作用以及通过多体谱分析线粒体翻译

(A) C2C12分化前后预测的miR-1靶点上的Ago2 CLIP-seq谱。每一种细胞类型的重复数据分别针对PITA预测的miR-1靶点中心绘制。

(B)在C2C12分化之前和之后已知的miR-1细胞质靶点上Ago2 CLIP标签。每个目标位点的染色体位置显示在每个面板的顶部。红色：CLIP标签；蓝色：CIMS标签。

① 通过miRACE，为此miR-1鉴定出多个线粒体转录本，以及细胞质靶点；

② 经过CLIP-seq与PITA预测结果显示，成肌细胞中miR-1靶点没有富集，但在肌管中有明显富集，这与只能在肌管中诱导miR-1表达结果一致；

③ C2C12细胞分化后，四个靶点与Ago2蛋白结合显著增加；

④ HDAC4在C2C12分化之前显示Ago2峰，表明还有另一种miRNA参与其中，但在C2C12细胞分化后，Ago2蛋白水平进一步提高。

6. C2C12细胞分化后，Ago2广泛结合线粒体中特异性RNA

图3通过CLIP-seq绘制Ago2- RNA相互作用以及通过多体谱分析线粒体翻译

（C）在C2C12细胞分化之前和之后，线粒体基因组中的Ago2 CLIP-seq标签的分布。带注释的基因显示在顶部。在基因轨迹的正下方显示了PITA预测的miR-1（绿色）和miR-206（红色）的靶点。CLIP标签分布（红色）和CIMS标签分布（深蓝色）分别映射到生长培养基（GM）中培养的C2C12成肌细胞和分化培养基（DM）中维持4天的C2C12肌管中的线粒体基因组。在两个CLIP面板之间指示了miRACE识别的miR-1目标位点的位置。

① PITA预测的其中两个靶点与miRACE鉴定的ND1和COX1基因中miR-1靶点中完全匹配；

② Ago2蛋白与多个线粒体特异性转录本结合，miR-1靶位点对应于多个Ago2蛋白诱导的CLIP-seq峰。ND1（峰1）上有一个主要的Ago2 CLIP-seq峰，ATP8（峰3）上有一个主要峰，COX3（峰4）上有多个峰，ND5（峰5和6）上有两个小峰，并且cytb的一个峰（峰7）；

③ Ago2蛋白还与12S线粒体特异性rRNA（Rrn1）结合；

7. C2C12细胞分化后线粒体翻译的多核糖体谱分析

图3通过CLIP-seq绘制Ago2- RNA相互作用以及通过多核糖体谱分析线粒体翻译

(D)多核糖体分析线粒体翻译。蔗糖梯度分离纯化得到的线粒体，Western blotting检测无标志性细胞质核糖体蛋白(RPS3和RPL4)，表示不含细胞质核糖体。Western blotting检测单个蔗糖梯度标志性线粒体核糖体蛋白(MRPS27和MRPL24)和Ago2, RT-qPCR定量特异性rRNA、mRNA和miRNA转录物。核糖体大小亚基、单核糖体和假定的多核糖体的分配是基于rRNA和蛋白质的分布，并与已发表的线粒体多核糖体谱进行比较。假定的多核糖体部分经RNase I处理后得到单核糖体。每个部分中个体转录本的相对丰度以总片段的百分比表示。增加的ND1和COX1转录本的多核糖体结合用深蓝色的条形标记，与从成肌细胞到肌管的增强做对比。

① 检测核糖体小亚基、核糖体大亚基、单核糖体，且分布趋势与12S rRNA和16SrRNA分布一致；

② C2C12成肌细胞和肌管中，蔗糖浓度梯度高的底部检测到了假定的多核糖体，可通过RNase I处理将其转化为单核糖体；

③ Ago2蛋白与成肌细胞中的28S、39S核糖体共沉淀，在较小程度上与单核糖体或假定的多核糖体共沉淀，并且这种共沉淀分布情况在肌管上变宽，表明还存在其他诱导的相互作用。

8. miR-1在细胞质中的功能与线粒体中相反

图4miRNA对细胞质翻译的影响与对线粒体的相反

(A)转染miR-1或对照siRNA后，在C2C12成肌细胞中进行HDAC4和ELL2的Western blotting。

(B)用对照RNA或miR-1转染C2C12成肌细胞48小时后，用Western blotting检测ND1和COX1。

(C)对照RNA或miR-1转染野生型和Ago2敲除纤维细胞，检测细胞中ND1和COX1蛋白水平。

(D)AntagomiR-1阻断了miR-1的表达，减少了肌管中ND1和COX1的翻译增强。本实验首先用对照RNA orantagomir-1转染C2C12成肌细胞，24小时后转入分化培养基。再培养3天后进行ND1和COX1的Western blotting。肌动蛋白和5S rRNA作为蛋白质和RNA的内参。下图显示AntagomiR-1对ND1和COX1的mRNA转录水平均无影响。

(E) miR-1增强转染的C2C12成肌细胞中复合物I和IV的活性。

(F) antiagomir -1阻断了C2C12肌管中ATP的生成。

① miR-1抑制细胞质靶点HDAC4和新鉴定的靶点ELL2蛋白的表达；

② 在未分化的C2C12细胞中，miR-1对线粒体ND1和COX1转录本无抑制作用，其翻译增强；

③ Ago2敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），未显示miR-1对COX1和ND1的翻译起增强作用，miR-1对COX1和ND1的翻译增强作用受到均依赖于Ago2；

④ 在C2C12成肌细胞中，miRNA 抑制剂AntagomiR-1存在使miR-1对ND1和COX1蛋白表达几乎没有影响，但AntagomiR-1减弱了miR-1的表达，并阻止了ND1和COX1翻译增强；

⑤ 在miR-1转染的成肌细胞中，含ND1的复合物I和含COX1的复合物IV的活性均升高；

⑥ 在C2C12细胞分化后，ATP的产生也得到了增强，而在antagomir-1存在时ATP产生增强效果显著减弱。

9. miR-1诱导的线粒体翻译增强的碱基配对

补充材料：荧光素酶报告基因检测

图4 miRNA对细胞质翻译的影响与对线粒体的相反

(G)miR-1增强了ND1蛋白的合成，但不影响其在转染的HeLa细胞中的mRNA水平。

(H)miR-1诱导转染的HeLa细胞中ATP的产生。

图5miRNA和miRNAmimic的靶点特异性效应

(A) miR-1及其3’和5’突变型的序列。图中显示野生型miR-1的计算出的碱基配对的自由能。

(B)对转染野生型和突变型miR-1的C2C12成肌细胞进行Western blotting(上图)和RT-qPCR(下图)分析。

① miR-1结合萤光素酶报告质粒COX1与ND1中3‘UTR区的靶点，导致细胞质的翻译抑制，而突变miR-1无抑制作用；

② miR-1的刺激翻译作用似乎不是由诱导的肌发生或mtDNA复制增加引起的；

③ 在非肌源性HeLa细胞中，miR-1能够增强ND1蛋白翻译和ATP产生；

④ 在ND1和COX1中比对上的miR-1靶位点遵循碱基配对原则，COX1和ND1的靶序列中间和3'端的序列在进化过程中演变得更加保守；

⑤ 对miRNA miR-1 5'区域或3'序列进行突变，两个突变均消除了miR-1诱导的ND1和COX1翻译增强，mRNA水平保持不变；

⑥ 野生型miR-1及其突变体均未显示出对核DNA编码的线粒体蛋白COX4有任何作用。

10. 多种miRNA在增强线粒体翻译中起直接作用

图5miRNA和miRNAmimic的靶点特异性效应

(C)miRNAmimic及其与COX1和ND1的碱基配对潜力。根据计算得出的自由能，miRCOX1与ND1的碱基配对少，而miRND1与COX1无法碱基配对成功。

(D)通过Western blotting分析（上图）用miRCOX1和miRND1转染的C2C12成肌细胞，定量特定蛋白水平（下图）。

(E)显示miR-101和miR-499-5p在ND1转录物中具有不同区域的碱基配对电位。

(F)Western blotting分析用一组miRNA转染的C2C12成肌细胞，其中两个（miR-101和miR-499-5p）增强了ND1蛋白合成，但不增强COX1蛋白合成。miR-1作为阳性对照。

(G)与HA-Ago2或线粒体靶向的Su9-HA-Ago2互补的Ago2敲除MEF的共聚焦显微镜分析。线粒体由共转染的线粒体GFP标记。

(H)在Ago2敲除的MEF上对Ago2功能的常规和选择性挽救。对含有与miR-1完全互补序列的荧光素酶报道基因分析其在细胞质中的Ago2介导的RNAi效应（上图）。数据显示，HA-Ago2可以挽救RNAi效应，而线粒体靶向的Su9-HA-Ago2不能挽救RNAi效应。中间图表示标记的Ago2的表达以及在不同的Ago2互补的MEF中转染的miR-1的ND1和COX1表达水平。

① 设计了两个靶向特异性miRNA mimic，miR-COX1更有效地靶向COX1，但是其靶向ND1的潜力降低，而miR-ND1仅靶向ND1；

② 转染的C2C12成肌细胞中，我们发现miR-COX1增强了COX1蛋白表达，对ND1蛋白表达的影响较小，miR-ND1仅刺激了ND1蛋白表达；

③ miRNA miR-101：针对ND1中的特定区域，miR-499-5p：针对ND1中的其他区域，两者都可以增强了ND1的翻译，而其他非靶向miRNA无增强翻译效果；

④ 共聚焦显微镜显示Su9-HA-Ago2与线粒体的成熟标志物Mito-GFP共定位，而HA-Ago2分散地定位在细胞质中；

⑤ miR-1完全互补序列的基于RNAi的荧光素酶报道基因，在野生型中MEF中基因表达有效抑制，但在Ago2敲除MEF中却没有被有效抑制；

⑥ 外源HA-Ago2蛋白挽救了RNAi作用，恢复了miR-1对ND1和COX1翻译增强作用，而针对线粒体的Su9-HA-Ago2无法挽救细胞质中的RNAi的作用，但有效恢复了线粒体中RNAi作用；

11. miRNA增强线粒体的翻译

图6 miR-1增强了线粒体中的蛋白质合成

(A)当依美丁Emetine阻断细胞质翻译时，检测线粒体中新生蛋白质的合成。首先用对照RNA、miR-1或miR-499-5p转染C2C12成肌细胞，并在存在Emetine的情况下通过加入人抗组蛋白抗体AHA监测蛋白质的合成。细胞质肌动蛋白和线粒体VDAC作为参照。Emetine阻断所有细胞质的翻译，以检测线粒体的翻译活性。红色箭头通过miR-1或miR-499-5p突出显示各个升高的条带。

(B)缺乏miR-1对ND1蛋白稳定性的影响。在对照和miR-1转染的C2C12细胞中，在存在INN的情况下检测蛋白质水平，以0时点ND1的蛋白质水平对数据进行标准化。

① 细胞质翻译抑制剂依美丁Emetine与线粒体翻译抑制剂氯霉素（INN）可以有效阻断细胞中的所有翻译活性；

② 存在Emetine但无INN时，miR-1显著增强了COX1蛋白的表达，ND1、cyt b、COX3和ATP8蛋白的表达一定程度上也有增强；

③ miR-499-5p对COX1蛋白的表达没有影响，但增强了ND1蛋白的表达，还增强ND4L蛋白的表达；

④ 使用INN，我们检查并排除了miR-1对ND1蛋白质稳定性的潜在影响。

12. miRNA依赖性翻译激活关键蛋白Ago蛋白与GW182结构分离

图6 miR-1增强了线粒体中的蛋白质合成

(C)线粒体对GW182及其旁系同源基因TNRC6B和TNRC6C的限制。Lamin A / C从线粒体中纯化出来。ND1和Tom20作为定位在线粒体内或与纯化线粒体外膜相关的蛋白质的对照。

(D)当通过抑制细胞质中的GW182选择性使miRNA机制失活时，miR-1增强了线粒体翻译。GW182显示了预期的miR-1要求，使其能够作用于其细胞质靶标HDAC4和Hand2（上图），以及作用于在ND1中包含miR-1靶向位点的细胞质萤光素酶报告基因（下图）。当miRNA机制的功能在抑制GW182的细胞的细胞质中受到很大降低时，转染的miR-1后增强线粒体ND1翻译的能力。

① miRNA依赖性翻译抑制转化为激活的三个关键要求：

（1）mRNA 5‘端没有帽子结构；

（2）在mRNA 3‘端缺少典型的poly A尾；

（3）Ago蛋白与GW182结构分离，GW182结构不参与miRNA增强翻译过程；

② GW182仅在细胞质中检测到，所有三个GW182家族蛋白均不存在于线粒体中；

③ GW182 RNAi处理阻止了miR-1介导的两个细胞质靶点HDAC4和Hand2的翻译抑制，及细胞质中含ND1的miRNA靶点的荧光报告基因的表达；

④ GW182 RNAi处理的C2C12成肌细胞中miR-1增强的ND1翻译。

3.实验讨论

1. 特定的线粒体miRNA与Ago2选择性靶向线粒体

本研究中使用高度纯化的线粒体进行蛋白酶和核酸酶保护分析来研究线粒体中仅存在miRNA机制，定量数据也证明了大部分Ago2和miR-1确实存在于线粒体内，尤其是当C2C12细胞处于分化成肌管时。

Ago2如何能够选择性进入线粒体仍是未知。先前的研究预测了Ago2蛋白N末端附近的线粒体靶向序列，我们将该序列与GFP融合，但未能检测到其将GFP靶向线粒体的能力。大多数核DNA编码的线粒体蛋白都不包含任何可识别的线粒体靶向序列，这表明存在将胞质蛋白导入线粒体的其他机制，例如线粒体和内质网之间的联系。

miRNA是如何进入线粒体仍是未知。多种特异性和非特异性的miRNA无需ATP水解提供能量下能够进入纯化的线粒体。因此怀疑，尽管大多数miRNA可能被束缚在其细胞质靶点上，而新合成的、“游离”的miRNA可能会进入线粒体。

2. 线粒体中的miRNA / Ago2复合物增强翻译

miRNA / Ago2复合体在线粒体中增强翻译的证据：（1）Ago2蛋白与特定mtDNA编码的转录本直接结合；（2）遵循特定碱基配对原则才能产生作用；（3）以线粒体为靶点的Ago2可对Ago2敲除的MEF细胞进行功能性抢救；（4）GW182敲除使细胞质中的miRNA机制选择性失活，不影响线粒体中miRNA增强翻译机制。

miRNA / Ago2复合物如何增强线粒体翻译是未知的。因为完全加工的线粒体转录产物不包含帽子结构，也不包含任何可识别的核糖体结合位点。根据Ago2蛋白的定位数据，可注意到Ago2与12S rRNA的广泛相互作用，Ago2与线粒体转录本也广泛关联，其中有一些为特异性结合，而其他以更连续的方式，这些转录物被“包裹”在含Ago2的复合物周围。由此推测Ago2可以充当关键的线粒体翻译起始因子，以促进核糖体与mRNA的相互作用。 

3. 调整的miR-1调控肌肉生成机制

SRF，MyoD和Mef2诱导miR-1表达，而miR-1抑制HDAC4蛋白表达，从而抑制了Mef2，升高的Mef2进一步激活了miR-1的表达，从而形成了自动调节环以维持肌肉生成过程，促进肌肉细胞分化；

miR-1抑制Hand2蛋白表达，影响细胞周期，从而抑制细胞增值；

增加了miR-1在增强分化的肌肉细胞线粒体中蛋白质合成和ATP产生中，暗示了miR-1在肌肉分化期间和之后协调细胞质和线粒体中的调节网络。

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