这种低起始RNA量又简单快捷的m6A测序技术，你就不想看看吗？|m6A专题

一．概述

RNA修饰被认为是一种基因转录后调控的重要方式。目前已经发现150多种修饰，其中m6A是丰度最高特征最显著的修饰。M6A修饰异常时，可以扰乱致癌基因和肿瘤抑制基因的表达，从而引起诸如癌症等许多疾病，表明m6A可以作为疾病诊断过程中的一种生物标记。

甲基化RNA免疫共沉淀高通量测序(MeRIP-Seq 或m6A-Seq) 是目前应用最广泛的m6A检测技术，但该技术通常需要大量起始RNA样品（>100μg总RNA），难以应用于微量样品的m6A检测，限制了其在临床稀缺样品和早期胚胎发育等场景中开展m6A研究。

该领域急需一种适用于低起始RNA量、简单快捷的m6A高通量测序技术。

本文提出了一种新的微量m6A测序技术：tMeRIP-Seq。该技术通过oligo(dT)引物特异性地反转录含有PolyA尾的mRNA，利用Tn5转座酶切割RNA/DNA杂合链的特性，将mRNA/DNA杂合链片段化(~200nt),同时加上测序接头，然后通过常规免疫共沉淀后，直接PCR即可获得测序文库。

这一技术极大地降低样品初始投入量并简化实验操作。基于这一策略，该研究以低至60ng总RNA为起始模板，鉴定到数千个可重复m6A位点，这些位点特异地富集于基因3′末端附近，并且有典型的RRACH基序。之后研究者应用该技术从一滴血中鉴定了m6A图谱，发现多个血液疾病相关基因可能受m6A调控。

基于类似原理，tMeRIP-Seq技术未来还可能拓展到其它RNA修饰研究中。

二．本研究tMeRIP-seq与LC Clontech的比较

	比较项	LC Clontech	tMeRIP-seq
建库	最低起始量	3ug	60ng
RNA质量	较低	较高
插入片段大小	~200nt	~200nt
建库方式	链特异性	非链特异性
建库方式	rRNA去除	oligo(dT)引物反转录mRNA
数据	比对率	>90%	80%-90%
数据中RNA种类	Misc RNA、lncRNA等非编	mRNA
Peak 峰数目	较少	较多
M6A图谱	3′UTR附近	3′UTR附近
Motif	RRACH	RRACH

说明：

1.起始量方面：目前Lc clontech微量m6A建库最低起始量是3ug，本文中tMeRIP-seq最低起始量是60ng，远远低于Lc clontech微量m6A建库。

2.RNA质量：Lc clontech微量m6A建库采用的是去除的方法，相对来说对RNA的完整度要求没那么高，tMeRIP-seq采用的是oligo(dT)引物反转的方法，对RNA质量的要求相对较高，不然容易出现数据偏好性。

3.文库大小：本文中的 tMeRIP-seq与Lc clontech微量m6A建库，文库插入片段都是~200nt，说明目前LC的片段化条件是比较合适的。

4.建库方式：Lc clontech微量m6A建库是链特异性建库，但是tMeRIP-seq因为用的是Tn5接头，属于非链特异性，这点相比，Lc clontect微量m6A建库更有优势。

5.建库方式：目前Lc clontech微量m6A建库，采用的是去核糖体的方法，导致数据中misc_RNA ，sno_RNA，lncRNA等非编码RNA的大量表达，导致input文库unique比例低。tMeRIP-seq建库先用oligo(dT)引物反转录带有poly(A)的mRNA,同时也是分离mRNA的作用，其数据中只有mRNA，没有其他非编码mRNA,理论上其input数据的unique比例会相对高些（但是此部分数据没有展示）。

6.总之，两种技术各有千秋吧，总体来说tMeRIP-seq相对来说更占优势。

三．本研究具体内容

1.比对率：

我们用来自HEK293T 细胞系不同起始量的RNA（500ng,200ng，100ng和60ng）作为起始材料，发现比对率约为80%-90%（图S2A）。为了进一步减少起始量，我们跳过RNA分离和纯化过程，直接用RT酶和Tn5作用于细胞裂解液（图1A）。

我们测试了2000，1000，500和200个起始量的细胞。mRNA占比和片段化大小类似于用纯化的total RNA。但是比对率降低，约60%-75%（图S2A）。相关性分析一致（图1B）。

图1

免疫沉淀效率影响MeRIP-seq的准确性。已有报道称m6A抗体难以与结构RNA结合。为了确保免疫效率，我们设计了两种免疫沉淀方法(图1C）。

方法I中，Mrna/DNA杂合体在95℃变性10min，部分链打开以增强IP效率，IP后直接PCR。方法II中，Mrna/DNA杂合体在95℃变性20min，DNA去除，RNA进入下游的IP，IP后先RT再PCR。测序结果显示，方法I的mapping率比方法II高（图1D）。

本研究中，替换传统的PCR前先洗脱IP磁珠上的RNA，不洗脱直接连同IP磁珠一起PCR（图1C）。

图2

2.甲基化图谱：

接下来我们评估了用tMeRIP-seq方法进行低起始量建库的甲基化谱。甲基化位点主要分布于终止密码子附近（图1E-1F）。经典的RRACH基序也可以被检测到。并且我们发现m6A峰倾向于在较长的外显子内存在。随着m6A峰数目的增加，m6A峰的密度也增加，表明m6A峰不是均匀地分布在全转录组范围内的。包含m6A位点的转录本表达量也增加，且m6A位点越多，表达量越多。

3.与MeRIP-seq比较：

然后我们比较tMeRIP-seq检测到的m6A峰与已发表的文献中检测到的m6A峰，发现有60%的重叠峰，且这些峰的相关性很好（图1G）。用同样起始量的RNA（500ng total  RNA）, 与MeRIP-seq相比，t MeRIP-seq可以检测到更多的m6A峰，峰的分布也更接近GGACH基序（图5SA-5SB）。

图5

4.运用tMeRIP-seq技术鉴定一滴血中m6A图谱

已经证明了低起始量tMeRIP-seq的可行性和准确性，我们用该技术对从一滴血（5uL）人血中分离的70ng total RNA进行测序，鉴定到了包含RRACH基序的2300个m6A峰，这些峰主要在终止密码子附近富集，更倾向于较长的外显子。有趣的是，包含m6A峰的转录本被激活，表明m6A可能作为血液病例的一种新的生物标记。对包含m6A峰的基因进行GO分析，发现这些基因主要与细胞增殖、发育、分化、免疫应答相关。多个与血液疾病相关的基因如BCL2,SP1可能与m6A调控有关。

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