基于质谱的单细胞蛋白质组研究进展|蛋白质组学
蛋白质是生命活动生理功能的执行者，它更直观的表现生命的活动现象，它直接参与机体的免疫应答、免疫调节和催化过程。
蛋白的表达的差异的水平会更直观的反应机体的生理状况和发病机制，蛋白质的定量检测对疾病的诊断、预后评价有着重要的意义。
我们通常研究的蛋白质组更多的是通过基因组、转录组的信息对蛋白信息进行预测，从中心法则DNA到mRNA再到蛋白，由于转录水平调控、翻译后水平调控、翻译后调控的存在使得DNA的遗传信息和mRNA水平丰度不能真实的直接反映蛋白质的功能和表达水平。
传统组织上的蛋白定量更多的是反应细胞中蛋白表达的平均值，由于遗传因素、生化噪音、细胞微环境等诸多因素使得细胞和细胞之间存在广泛的异质性。
如果能从单个细胞反映生命活动的直接体现者，不仅对生命的本质有更深的认识，而且会为疾病的诊疗提供强有力的支持。
相对与对基因表达分析，测定单个细胞中的蛋白是个更大的挑战,单细胞的蛋白含量非常低，平均每个细胞中约包含8*109个蛋白质分子（700pg），但却含有一万多种蛋白质，某些种类的蛋白质分子甚至小于100个。蛋白的表达量的测定无法直接像DNA、RNA那样直接扩增。
在2020年发表在顶级期刊的MCP（Mol Cell Proteomics）的综述：单细胞蛋白质组学进展与展望中文章从也对样品制备、到质谱仪、方法学的难点进行详细讨论。
当然基于不同的原理、针对不同的应用场景近些年来也涌现了很多单细胞蛋白质定量的的检测方法，比如微流控技术、微孔技术、光纤纳米生物传感技术、荧光探针技术和基于质谱的单细胞蛋白检测技术。
如微流体技术Health课题组通过单细胞条码芯片( single-cell barcode chip，SCBC) 的方法来进行单细胞蛋白检测，对单个肿瘤的细胞蛋白质进行了多重分析。
Huang等也利用微流控技术在一张芯片上完成细胞的处理、裂解、标记、分离和蛋白定量检测过程，Salehi-Reyhani等基于微流控抗体芯片实现单细胞中P53肿瘤抑制蛋白丰度检测,该方法更多的用于蛋白和蛋白间的会做及磷酸化的作用的研究。
以Health 课题组微流控举例（如上图）
a)单细胞、细胞内蛋白质分析装置的示意图。
将单个或少数细胞置于不同刺激下的隔离室中培养。通过引入预先引用的裂解缓冲液来检测细胞内的蛋白质，释放的蛋白质在腔内结合到DNA条形码上。
V1:裂解缓冲液控制阀，V2:隔离室形成阀，R1: DNA条形码阵列转换成DEAL抗体阵列
b) c)已开发的条形码检测的对比增强图像。用红色字体列出的蛋白质名称与使用条形码检测的蛋白质名相称对应
d) b单细胞裂解液具有代表性的荧光强度分布图
微流控技术本身更依赖于装置的设置，装置的设置决定于单细胞蛋白检测的通量,一般情况下检测10-1000个不等的蛋白，具有很高效益和灵敏度，但是自制的微流控很难保证一个微室保证一个单细胞。
微孔技术对于单细胞蛋白的检测方法包括数字化酶联免疫吸附测定法、单细胞蛋白印迹法、基于DNA的纳米免疫测定法，它们主要的缺点和微流控一样，不同的微孔中存在差异，难以保证一个微孔正好捕获一个细胞。
而质谱的方法其灵敏度较高，通过已有的蛋白质组学数据库，同时可以对上万种蛋白同时进行定量。我们重点和大家分享基于质谱的单细胞蛋白质组的研究方法。
质谱的单细胞蛋白质组主要需要解决样本的复杂性和提高单细胞的灵敏度，质谱前处理和分离技术的选择对此发挥着至关重要的作用，根据质谱分析前分离技术的差异，主要从毛细管电泳-质谱（CE-MS）、液相色谱-质谱（LC-MS）进行简要介绍
早在2014年，Sun等通过电驱动鞘液型接口将毛细管区带电泳与串联质谱结合，实现300ngHela细胞的蛋白酶解液中鉴定2100种蛋白，最低的检测限可以低至 2 amol。
除了在Hela细胞进行测试，Nemes课题组首次较大的单细胞进行内源的蛋白质分析-16－细胞非洲爪蟾早期胚胎的囊胚细胞。
首先通过显微解剖的方法从胚胎中分离单细胞，然后裂解、还原、烷基化，最后通过毛细管电泳-升电喷雾-高分辨质谱（CE-μESI-HRMS）从直径约150μm的20ng单个囊胚细胞鉴定1630种蛋白。
除了通过显微解剖的方法还可以通过微采样的方法，微采样的方法消耗样本量少，流程简化，排除显微方法使用基质使得单细胞的蛋白鉴定更准确。
比如Lom-bard-Banek等对胚胎进行亚细胞区域采样，提取物在压力的作用下转移至微量移液管中进行胰蛋白酶解，最后实现进样10nL酶解液，利用利用毛细管电泳-纳升电喷雾-高分辨质谱分析，最低低于700z mol的检出下限，在5ng蛋白酶解液中鉴定不少于800个蛋白。尽管蛋白的量和检测下限逐渐减少，但样本的复杂度依旧很高。
Choi等通过CE前加入用于预分离的反相C18柱，对单细胞水平的老鼠海马体神经元蛋白酶解物进行分析，最后从500pg的蛋白酶解物鉴定141个蛋白。
这一灵敏度近乎达到了单细胞的水平，但是样本的复杂度还不是单个细胞的水平；为了近乎接近单个细胞的水平，利用毛细管的微小管径实现单细胞内容物的转移。
如Zhang等通过利用管径10μm的毛细管对田螺特定的神经元细胞质和细胞核取样，利用离子淌度质谱（IMMS）发现了新的神经肽，揭示了神经元细胞内区域表达的异质性。
通常CE-MS的研究应用更多集中在大体积的细胞上，实验流程基本和常规蛋白质的提取和鉴定方法一致。
利用比单细胞更小的毛细管管径对亚细胞区域进行提取和鉴定是毛细胞管电泳的一大特色，也是离传统意义单细胞最接近的技术手段。
毛细管电泳-质谱需要面临仍然有很多问题：CE与质谱接口的稳定性、重复性、电泳吸附时面临损耗，未来单细胞之路实现简单、容易操作的标准化还是需要不断更新和探索。
对于毛细管电泳来说，液相色谱中的纳升液相色谱（nanoLC）其重现性、nL级别的进样、超低的流速（nL/min）、较少的样品损失等特点在单细胞蛋白质组学的应用范围更广。
Sun等利用纳升液相色谱的反相分离模式研究了非洲爪蟾早期胚胎的囊胚细胞，单次实验从16细胞分裂阶段的细胞中鉴定1400多个蛋白，通过比较不同阶段蛋白质的表达情况，证实了随着分化程度的不断加深，囊胚细胞间的异质性逐渐增强。
Slavov课题组发展一种基于LC分离的单细胞蛋白质定性以及相对定量方法-单细胞蛋白组学质谱（SCoPE-MS）。
该方法首先在显微镜下将单个Hela细胞挑选至玻璃管中，经过超声破碎、过夜酶解等蛋白质前处理步骤，利用TMT标记技术对不同细胞间的蛋白质进行相对定量，整个过程中引入载体“carriers”概念，利用单独的TMT通道进行标记，在于待测细胞混合后同时检测，载体的存在减少了单细胞表面依附造成的损失，为质谱离子化提足够的多肽，增加后续肽段的鉴定。
这一概念为单细胞技术的发展提供了重要参考。为了解决通量的技术，后续改进在纯水中冷热交替实现细胞裂解，引入微孔板进行细胞样品处理从而提高通量。
Sun等利用纳升液相色谱的反相分离模式研究了非洲爪蟾早期胚胎的囊胚细胞
A)爪蟾胚胎显微照片。B)从胚胎分离的单个卵裂球单细胞蛋白质组学的工作流程
2018年Nature Communications在线发表“Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells”的研究论文，是由美国华盛顿州国家环境分子科学实验室的Ryan T. Kelly团队最新研究成果。
基于质谱(MS)的蛋白质组学方法大部分需要包含至少数千个细胞的样本来提供深入的分析，课题采用了基于芯片的纳升级微量液滴蛋白处理系统nanoPOTS。
该平台nanoPOTS (nanodroplet processing in one pot for trace samples) 可以基于小细胞群体进行蛋白质组学的分析，nanoPOTS可将处理量降低至200nL以下，减少表面损失，提高了样品的效率和回收率；与超灵敏的液相色谱质谱联用仪相结合时，nanoPOTS可以从10-140个细胞中鉴定到约1500-3000个蛋白。
NanoPOTS平台蛋白质组学的样品制备
NanoPOTS玻璃芯片是用光刻方式制作的亲水底座，周围环绕着疏水表面，作为多步蛋白质组学样品处理的纳米液滴反应容器(纳米井)。
芯片玻璃垫片密封在镀膜的载玻片上，以在各个培养步骤中最大限度地减少纳米孔内容物的蒸发。
通过芯片的纳升级微量液滴蛋白处理系统nanoPOTS，对细胞和组织沉积到每个腔室中
在腔室中完成样品的定量、蛋白的提取、烷基化和酶解等过程，最后保存冰箱中或转移至LC-MS进行后续分析。
nanoPOTS平台的灵敏性和蛋白质组覆盖度
1）利用NanoPOTS系统对HeLa细胞的敏感性和的蛋白质组覆盖率进行测试。
作者分别对10-14 、37-45 和137-141个Hela细胞进行测试，蛋白质的肽段鉴定范围在7364-17836。
蛋白质的鉴定范围在1517-3056个。
3）通过Maxquant的MBR的定性分析发现当最小到最大的上样量时，平均蛋白的识别率增加到3092、3215和3460，并且85%的蛋白是全部样品所共有的，进一步说明较少的样品中可以鉴定和定量到更多蛋白质。
基于液相色谱的单细胞处理体积逐渐降至nL级别，将一系列蛋白质在样品处理步骤整合在微小的体积中，通过设置密封条件、减少洗涤步骤等方式来降低样品的损失，进而结合nanoLC-MS进行分离和检测。
对于细胞裂解过程、蛋白前处理是否高效、是否对肽段标记等步骤仍然等是影响单细胞蛋白鉴定数目和种类的重要因素
无论是采用哪种原理实现标准化、应用广泛的单个细胞的蛋白质组仍有很多困难要克服，随着单细胞蛋白质组检测的灵敏度、蛋白覆盖度、细胞通量、空间分辨率等技术的优化，相信单细胞蛋白质组学在解决基础科研和临床转化问题的应用会更加广泛。
联川生物在2021年5月份已经开启微量蛋白质组学服务（只针对细胞样本），最低可以实现单个细胞的服务，详情可以联系当地项目经理和咨询技术支持！
声明：
文章如有侵权部分，请联系作者删除
文章仅用来做技术分享，关于技术保密归属权归原作者、企业或科研单位
文章不可用于任何商业用途
参考文献：
1.Labib M,Kelly S O Nat Rev Chem,2020,4(3):143
2.Jackson HW,Fisher J R,Zanotelli V R T et al. Nature,2020,578(7796):615
3.Stewart C A, Gay C M,Xi Y,et al. Nat Cancer,2020,1(4):423
4.Klosin A, Oltsch F,Harmon T,et al. Science,2020,367(6476):464
5.Sim CE,Allbritton NL.Analysis of single mamamalian cells on-chip.Lab chip 2007,7（4）423-440
6.Shin YS,Ahmad H,Shi Q,et al.Chemistries for Patterning Robust DNA MicroBarcodes Enable Multiplex Assays of Cytoplasm Proteins from Single Cancer Cells.Chemphyschem,2010,11(14):3063-3069.
7.Hughes AJ,Spellke DP,Xu Z,et al.Single-cell western blotting.Nat Methods,2014,11(7):749-755
8.Ganau M,Bosco A,Palma A,et al. A DNA-based nano-immunoassay for the label-free detection of glial fibrillary acidic protein in multicell lysates.Nanomedicine,2015,11(2):293-300
9.Sun L,Hebert A S,Yan X,et al.Angew Chem Int Engl,2014,53(50):13931
10.Sun L,Zhu G,Mou S,et al.J Chromatogr A,2014,1359
11.Lobard-Banek C,Moody S A,Nemes P.Angew Chem Int Ed,2016,55(7)2454
12.Choi S B,Lombard-Banek C,Munoz-Llancao P,et al.J Am Soc Mass Spectrom,2018,29(5):913
13.Zhang L,Khattar N,Kemenes I,et al.Sci Rep,2018,8(1):12227
14.Sun L, Dubiak KM, Peuchen EH, et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) Blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Anal Chem. 2016 Jul 5;88(13):6653-7
15.Budik B,Levy E,Harmange G, et al.Genome Biol,2018,19(1):161
联川出版社又双叒叕出新书了！蛋白质组学新书正式加入联川畅销书全家桶
Olink蛋白质组，见微识真| PEA原理的前世今生 | Olink蛋白质组学
【血浆蛋白组】PEA技术与基于质谱的蛋白检测技术的互补性研究 | Olink蛋白质组学
点击下方图片进入云平台资料汇总：
所见即所得，figure有bi格
联川云平台，让科研更自由