论文标题：RNA m6A reader YTHDF2 facilitates lung adenocarcinoma cell proliferation and metastasis by targeting the AXIN1/Wnt/β-catenin signaling
刊登日期：2021年05月
发表杂志：Cell Death & Disease
影响因子：8.469
研究机构：广州华侨医院（暨南大学附属第一医院）
技术手段：m6A-seq、转录组测序、联川生物Omicstudio云平台
文章架构：
作者对TCGA及CHOICE数据中的中国肺腺癌LUAD患者中的m6A甲基化转移酶、去甲基化酶、阅读蛋白进行整体评估后发现，METTL3、VIRMA、RBM15、RBM15B、HNRNPA2B1、HNRNPC、EIF3A、YTHDF1和YTHDF2的mRNA表达水平显着升高，LUAD中FTO较癌旁正常组织显着降低。后续作者继续在5个LUAD的GEO数据集中进一步分析YTHDF2表达，结合WB验证后证实LUAD组织中YTHDF2蛋白表达水平显著高于癌旁组织。依据TCGA数据和5个GEO数据进行生存分析后发现，YTHDF2高表达并不是LUAD患者的总生存期预后指标。但是较高的YTHDF2蛋白表达水平与LUAD密切相关。
2. 体内体外实验证实YTHDF2调节LUAD细胞增殖和转移侵袭
作者首先构建了A549和H1792两种细胞系的敲低稳转株shYTHDF2-A549和shYTHDF2和sh-H1792敲低YTHDF2显著抑制A549和H1792两种细胞系的增殖和克隆形成能力。相反，过表达YTHDF2会增强两种细胞系的增殖与克隆形成能力。
将shYTHDF2-A549细胞系和Control肺癌细胞系皮下注射进小鼠后发现，shYTHDF2-A549组肿瘤生长速度以及肿瘤重量显著低于Control的肺癌细胞系A549。总之YTHDF2对LUAD细胞增殖生长至关重要。
在A549和H1792中过表达YTHDF2能够显著增强LUAD的侵袭能力。
相反敲低YTHDF2显著降低侵袭转移能力。补救实验也证实，在敲除YTHDF2的细胞系中重新表达YTHDF2能够显著增强细胞增殖，并恢复其克隆和转移能力。总之，YTHDF2能够调节LUAD的增殖和转移侵袭能力。
3. 转录组和m6A测序联合分析锁定YTHDF2靶点
接下来作者对shCtrl-A549和shYTHDF2-A549进行m6A测序，发现peak主要富集在TSS、TES、3’UTR、5’UTR及ORF区。作者还挖掘了何川教授先前在Nature（Pubmed ID：24284625）上发表的关于m6A调节RNA稳定性这篇文章中PAR-CLIP和YTHDF2-RIP-seq的结果，与本次m6A测序结果取交集后，发现有678个基因在三组测序测序中均出现且这些基因大部分均富集到了Wnt通路。鉴于Wnt/β-catenin 信号通路与癌细胞增殖和迁移有关，作者假设m6A阅读蛋白 YTHDF2 的缺失可能通过 Wnt/β-catenin 信号通路的失活来抑制肿瘤生长和迁移。因此，作者锚定 Wnt/β-catenin 信号通路进行进一步研究。
作者选择AXIN1作为Wnt/β-catenin通路上负调节基因作为本次研究对象。由于YTHDF2能够介导带有m6A修饰的mRNA发生降解，所以在A549和H1792中敲低YTHDF2能够显著增加AXIN1的mRNA水平和蛋白水平（WB检测），相反过表达YTHDF2则AXIN1的mRNA和蛋白水平均下降。另外在敲低YTHDF2的细胞系中，AXIN1的m6A修饰水平显著增加。YTHDF2的RIP-qPCR也证实YTHDF2与AXIN1互作。mRNA稳定性测试实验中，采用放线菌素D处理后发现YTHDF2敲低组中AXIN1的mRNA稳定性更高。YTHDF2敲低后，Wnt/β-catenin通路上的FN1、MMP2、MMP7和CD44的mRNA表达水平以及c-jun、c-Myc和β-catenin 的蛋白水平均降低。相反过表达YTHDF2，趋势则相反。总之， YTHDF2敲低后AXIN1 mRNA水平上调，并抑制 Wnt/β-catenin 信号及其下游靶标。
5. AXIN1敲低补救了YTHDF2沉默的肿瘤抑制作用
作者构建了YTHDF2沉默载体和AXIN1敲低的A549稳转株。YTHDF2敲低本身能够降低细胞的侵袭增殖能力，AXIN1敲低能够补救恢复A549原有的侵袭增殖能力。
此外AXIN1敲低还能够恢复提高c-jun、c-Myc和β-catenin的蛋白水平。相反，AXIN1过表达能够抵消YTHDF2过表达所带来的细胞致癌表型。总之，这些结果表明YTHDF2敲低通过增加AXIN1表达和抑制 Wnt/β-catenin 信号传导来抑制LUAD发生和转移。