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超详细RIP实验流程，看完神清气爽
RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同，如：RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等。
RIP-seq
RIP-seq（RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing）是RNA免疫沉淀与高通量测序结合的技术，它通过免疫沉淀目标蛋白来捕获蛋白体内结合的RNA。将捕获的RNA进行高通量测序，可获得RNA结合蛋白（RBP）在体内与众多RNA靶标的结合模式，并对其结合强度进行精确定量，最终通过分析目的蛋白在体内结合RNA的动态变化，阐述出目的蛋白对基因表达调控的分子机制。
RIP 实验基本原理
用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。 防止非特异性的RNA的结合。 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。 结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。
技术流程
建库过程
RIP实验步骤
一、获取细胞裂解液
冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendoff管 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃
重悬磁珠 标记实验所需的eppendoff管 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管 每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡 将eppendoff管置于磁力架上，去上清，重复一次 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠 室温孵育30min 将eppendoff管置于磁力架上，弃上清 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上
准备RIP Immunoprecipitation Buffer 将前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml 4℃孵育3h至过夜 短暂离心，将eppendoff管放在磁力架上，弃上清 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次
准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物 55℃孵育30min 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer 于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡，室温下14,000rpm离心10min 小心吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管 于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min 小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管 每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干. 10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存。
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