单核转录组测序，这个步骤必须得有 | 流式专题

相较于单细胞转录组测序（scRNA-seq），单核转录组测序（Single-nucleus RNA-seq，snRNA-Seq）具有如下诸多优点，正被愈来愈多的研究者所使用。l 适用于冻存样本及其他不适宜解离的样本（如脂肪样本）l 支持含大细胞（>40 μm）的组织，如心肌组织，神经组织l 改善细胞偏好性，消除人为引入的基因表达l 与scRNA-seq具有类似的基因检测率然而，在将样本制备成单核悬液的过程中，难以避免会产生一些碎片，而核与细胞碎片（debris）的大小相似，不易区分，容易出现背景RNA数据含量偏高的问题，导致单核数据有效率下降（图1）。

图1 引入流式分选前（左）后（右）的单核转录组数据示例图

查看>> https://www.bilibili.com/video/BV1DY411a7zj/（精讲Cell Ranger 细胞鉴定曲线的含义）除了优化制备单核悬液的实验操作外，更为有效地方法是直接去除细胞碎片。而去除单核悬液中的碎片，最佳方式是采用流式细胞仪分选。图2是单核细胞悬液组成的示例，借助流式细胞图可以清楚地分辨出哪些是细胞碎片（红框）。通过使用PI或者7-AAD染色，单核悬液样本原则上会划分成3部分：1. 没荧光：完整细胞2. 弱荧光：碎片（RNA含量较低）3. 强荧光：核（RNA含量较高）

 图2 单核细胞悬液组成示例

图3是通过流式细胞分选前（左）后（右）的单核悬液的观察结果，可以看到细胞碎片被有效去除，背景非常干净。

图3 流式细胞仪分选去除细胞碎片

流式细胞仪分选去除细胞碎片的步骤：Step 1基于大小和粒度分选细胞核；Step 2使用7AAD染色细胞核，然后从背景和碎片中分离出来。在单核转录组测序工作中，引入流式细胞仪分选去除细胞碎片干扰，已成为越来越多课题组的必备步骤。我们现已将流式细胞仪引入单细胞产品线，为您提供高清单细胞测序服务（查看>>BD FACSAria II超高速分选流式细胞仪正式入驻联川）。

Palmer等使用snRNA-seq对唐氏综合征的前额皮质进行分析，以鉴定相关的细胞和分子修饰[1]。

Petrany等采用snRNA-seq鉴定多核骨骼肌纤维的转录异质性[2]。Wang等整合了全基因组测序、全外显子组测序、RNA测序、microRNA-seq、snRNA-seq、DNA甲基化芯片、蛋白质组、磷酸化蛋白质组、乙酰组、脂质组和代谢组等多组学数据，以表征人脑胶质母细胞瘤的蛋白质组学和代谢组学特征[3]。

参考文献

1. Palmer CR, et al. Altered cell and RNA isoform diversity in aging Down syndrome brains. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Nov 23;118(47):e2114326118.

2. Petrany MJ, et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nat Commun. 2020 Dec 11;11(1):6374.

3. Wang LB, et al. Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium. Proteogenomic and metabolomic characterization of human glioblastoma. Cancer Cell. 2021 Apr 12;39(4):509-528.e20.

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