空间转录组文献解读 | 空间转录组定义小鼠肝脏分区基因表达模式与结构组分

研究背景

哺乳动物的肝脏是维持代谢稳态及解毒的重要器官，形态学上往往将肝分成不同的叶区，如小鼠的肝脏可以分成内叶、左叶、右叶及尾状叶。每个小叶都由一些重复的结构单元组成，即肝小叶。门静脉（PV）位于邻近肝小叶间的连接处，富含营养的血液经门静脉由肠道进入肝脏，而耗尽养分及氧气的血液则经中央静脉（CV）排出。

肝脏中约80%的细胞都是实质细胞即肝细胞，剩余的细胞被划分为非实质细胞（NPCs），包括肝内皮细胞（LECs），肝巨噬细胞（Kupffer cells）及其他免疫细胞，肝星型细胞（HSCs）及其他基质细胞，胆道上皮细胞，以及脉管系统。这些细胞共同组成了肝小叶功能环境，它们沿着小叶轴，根据其与门静脉及中央静脉的距离行使不同的功能，这些代谢功能的不同分区被称为代谢区带（zonation）。小鼠中，根据不同的基因差异表达谱可以将这些区带分成三部分（共9个layer），即zone1-zone3。Zone1（layer1-layer3）在门静脉附近，zone3（layer7-layer9）在中央静脉附近，而zone2（layer4-layer6）则位于zone1和zone3的中间区域。单细胞空间重建的研究中发现，肝脏中的非实质细胞也根据其位置及沿小叶轴存在着差异的基因表达谱。这些重建的方法，给出了肝小叶微环境中复杂的代谢分区，鉴定了沿小叶轴的差异表达基因，并为肝分区研究提供了丰富的数据资源。然而，先前的这些研究基于显微激光切割或使用了灌注技术，这些技术均需要在测序前对组织进行解离，尽管实现了单细胞分辨率，但也在一定程度上改变了肝脏中的基因表达，不能完全准确地反应真实状况。

此外，之前的研究更多聚焦于小叶微环境，而横跨不同组织的小叶往往呈不规则排列，并在大小与轴向上存在着差异，各片小叶与肝动脉与门静脉之间也存在着距离差异，因此弄清这些重复的结构单元是如何组织排列的依然充满挑战。另一方面，肝脏为何被分为不同的叶区也依然不甚明晰，研究也表明不同的叶区间基因表达谱差异，表明他们可能具有不同的功能。为了更好地理解肝脏在维持稳态及一些疾病相关的功能，需要在每个叶区中理解不同细胞独立于组织结构的表达模式。

研究样本/数据

来自三只野生型小鼠的八张组织切片，包括肝右叶区及尾叶区。Mouse Cell Atlas（小鼠单细胞公共数据库，http://bis.zju.edu.cn/MCA/）中的肝组织数据。

肝切片空间转录组研究流程

研究结果

空间数据聚类定义肝组织中的基因表达分布

根据基因表达模式，基于图像驱动的无监督聚类方式，将组织覆盖的spot聚类成6个不同的cluster，并将cluster投射回组织切片中，不同cluster中的spot呈现了明显的分区。根据切片的注释，cluster 5定位在一个独立的区域，而cluster 1 和cluster 2则定位在肝脏组织的血管区域。差异基因表达分析（DGEA）进一步地对这些cluster进行了注释。门静脉周相关基因的表达在cluster1富集，而中心血管周围相关基因的表达在cluster 2富集，表明它们代表肝组织的门静脉区和中心静脉区域。Cluster 3富集的基因与血红蛋白相关，cluster 4的基因在免疫相关途径富集，cluster 5则存在间充质细胞富集。根据cutoff的设定，cluster 0中不存在显著的基因富集。Cluster3-5中的spot在肝组织上的分布显得比较分散，而cluster1和2中的spot则呈现集中分布。利用marker基因，研究分析了不同类型细胞在spot中出现的比例以验证空间数据的重复性与敏感性。不同细胞类型的marker基因在所有被覆盖的spot中表达的频率与这些细胞在肝组织中的比例趋向一致。那些高丰度或更大的细胞在肝组织中更广泛地分布，而稀有的细胞或体积较小的细胞的分布则较为稀疏。

空间数据聚类分析

为了分析细胞类型在空间中的分布，研究还将小鼠肝组织的单细胞公共数据用stereoscope方法映射到空间中去。以spot为单位，通过进行不同细胞类型的Pearson关联分析可以推测各种细胞类型在空间中的定位关系，若相关系数为证，表明两种细胞类型在spot中存在共定位。结果表明，非实质细胞（LEC，上皮细胞，大部免疫细胞和基质细胞）均存在共定位。门静脉周和中心肝细胞呈现负相关，表明它们在之间及与其他细胞类型之间的分布间隔，这两种细胞类型被相关的大部分spot均分布在cluster1和cluster2，故将cluster1和cluster2分别定义为门静脉周围区域cluster（PPC）和中心周围区域cluster（PCC）。PPC中富集的基因和PCC富集的基因之间Pearson相关性显示出负趋势，印证它们的空间分离。利用中心周围代表性的marker Glul和门静脉周围的代表性marker Sds的表达模式进一步证明了这两个区域间基因表达的异质性。

单细胞空间映射与细胞共定位分析

利用组织中marker基因的转录图谱对肝脏静脉进行注释

为了深入了解物理空间中的代谢分区，将代表性的marker基因（门静脉标记基因Sds，Cyp2f2及门中心周围标记基因Glul，Cyp2e1）富集的spot映射到经组织学注释的切片上。Glul仅在靠近中心静脉周围富集，而Cyp2e1的分布则更加均匀。在附带注释门静脉周围均无法检测到这两个基因。对于Sds和Cyp2f2则存在着相反的表达模式。研究进一步地包括了PCC和PPC的所有标记基因，并创建了组织中spot cluster的所有DEG模块的表达分数，将这些基因沿小叶轴的共表达梯度进行了可视化。

那么，基因的表达是否与不同静脉类型的空间接近度相关呢？文章生成了基于距离的表达图谱用以描述归一化的基因表达与给定的静脉类型间的单变量模型。门静脉的标记基因随着与门静脉的距离增加而逐渐下降。对于中央静脉，某些基因（如Glul、Slc1a2和Oat）的表达随着距中央静脉距离的增加而急剧下降，而其他基因（例如Cyp2e1和Cyp2a5）的下降幅度较为缓慢。这些结果与先前的研究观察到的表达梯度一致。

更深入地，研究同时结合与门静脉和中央静脉来判断基因的表达模式，建立了二元线性模型。基于该模型，对于两种不同的静脉标记基因，均观察到靠近门静脉或中央静脉的高表达到相反位置的低表达模式。这表明两种静脉的距离同共同影响两类标记基因的表达。鉴于PPC和PCC中DEG之间的强关联关系，以及组织学注释的中央和门静脉共定位的令人信服的证明，显示了这种基于基因表达并以计算的方式注释中央和门静脉的潜力，可以对基于经验的组织学注释进行补充，尤其是对于难以分辨的结构成分。

基因表达沿叶轴的梯度变化及静脉类型的注释

探索肝组织异质性相关组分

空间数据聚类中，cluster 5在整张H&E染色切片中在整个肝组织中体现了多个区域的零散分布，因此需要基于它的基因表达情况，明确这个cluster是如何整合肝脏的空间空间结构中去的，此外还需评价该cluster所在的空间组织是否可以指示该组织区域中潜在的不同形态结构和功能。差异表达基因分析鉴定到Gsn，Col1a2，Col1a3和Vim是cluster 5中表达上调的标记基因。Cluster5中标记基因的通路分析表明这些基因富集在胶原和纤维组织相关途径上。胶原纤维是组成肝纤维囊不规则连接组织的重要组成成分，表明cluster 5的潜在功能于此相关。此外，结构形成及发展相关以及免疫相关途径也在cluster5上富集。参与胶原蛋白和纤维组织相关的标基因的表达分数在cluster5的spot以及相近的组织中最高，而其余的表达分数较低。相比直线，参与细胞因子反应的标记基因（H2-Eb1, Timp2, Timp3, H2-Aa, Cd74,H2Ab1, Spp1, Gsn, Col3a1, and Vim）则更均匀地分布在组织中。这些结果也支持cluster5覆盖及周围的区域在组织建成和发育中的重要性。此外，cluster5中的标记基因与单细胞数据中肝实质细胞的标记基因高度重合，表明cluster5在空间组织上是一个独立于肝功能分区的结构。

鉴定肝组织中具有独立表达模式的结构分区

总结

这项研究展示了通过空间转录组及计算手段展现肝组织转录景观的有效途径，并开发了计算工具，可以基于空间距离的测算来预测难以难以区分的组织成分如静脉。此外，还在肝脏组织中观察到了转录水平上不同的肝组织结构区域，这在肝脏转录组研究中尚属首次。

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