单细胞测序联合多组学揭秘小鼠全能干细胞制备

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）一直是人们研究的重点，其中分化能力最强的全能干细胞具备最强的潜能，可以分化成为胚内和胚外组织，但是目前体外培养的干细胞株大多数停留在多能干细胞状态，分化潜能相对较弱，只能分化成胚内组织。如何能够在体外培养体系中获得分化潜能更高的干细胞，一直是一个重大的难题，这一难题限制了干细胞研究在转化医学和基础生理学等重要领域的进一步突破。

本文中，作者从不同的剪接因子水平在胚胎发育过程中的动态变化入手，利用剪接抑制剂对细胞进行处理，获得了小鼠全能干细胞，并根据该细胞的特性命名为totipotent blastomere-like cells（TBLCs），这一发现是干细胞领域的一大重要突破。

研究者先从RNA测序数据中，找到了8细胞胚胎阶段之后显著表达升高的剪接因子，并使用户siRNA干扰技术将其中14个剪接因子敲低。其中10个被敲低的剪接因子诱导了全能分化marker ZSCAN4和MERVL的表达，显示了剪接体抑制可以诱导全能分化基因的激活。

之后研究者尝试使用剪接体抑制剂来处理，看是否能够获得稳定的全能干细胞。研究者选用的剪接体抑制剂是Pladienolide B（PlaB），通过结合SF3B复合体来进行剪接体抑制的功能。在使用PlaB处理之后，研究者通过qPCR检测到了多个全能基因被诱导表达，包括ZSCAN4s，BTG1，BTG2，DDIT4L等。而用PlaB处理的小鼠干细胞能够被诱导为全能干细胞，并且在分裂后仍然保持全能性。通过转录组鉴定，这些全能干细胞具有接近2-和4-细胞卵裂球的转录组特征，所以研究者将它们命名为totipotent blastomere-like cells（TBLCs）。

除了转录层面的特征之外，研究者通过翻译组等组学手段发现在表观层面，TBLCs同样具备和2-和4-细胞卵裂球相似的特征，同时与之前的研究者获得的EPSC（扩展多能性干细胞）存在显著的差异。而多能干细胞到TBLCs的转化可以通过PlaB这一单一的剪接体抑制剂来进行诱导。通过细胞实验和单细胞测序发现，TBLCs具备分化成多种胚胎和胚外细胞系的能力，具备非常强的分化潜能。

为了进一步探究PlaB诱导全能干细胞激活的机制，研究者发现经过PlaB处理之后，包含多能基因在内的1000多个基因被沉默，而包含全能基因在内的600多个基因的表达被激活，说明了PlaB诱导的细胞重编程过程。剪接体抑制能够显著地降低基因的剪接效率，诱导出现广泛的剪接抑制，内含子滞留等现象被广泛地检测到，但是全能基因的剪接在药物处理的6h内并未受到显著影响。上述结果说明了剪接体抑制剂PlaB能够诱导产生全能干细胞，具备类似2-或4-细胞卵裂球的分化潜能，而剪接抑制剂能够在细胞中诱导出现广泛的剪接抑制功能，但含有较少、较短内含子的全能基因则在这个过程中很少受到影响，这可能是剪接体抑制剂诱导产生全能干细胞的主要机制。

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