用户文章 | 三体综合征单细胞测序高分文章解读

杂志名称：Human Genomics

发表时间：2021

发表单位：深圳市人民医院

所用组学：单细胞ATAC测序

研究背景

18三体综合征（Edwards综合征，ES）是一种由于18号染色体额外增加一条的非整倍体染色体变异遗传性疾病，是导致早孕丢失、智力残疾和多胎妊娠的主要原因。本研究通过对来源于一名ES患者和一名健康捐赠者的脐带血细胞进行sc-ATAC-seq分析，描绘了与ES相关的单细胞图谱及染色质可及性，并发现了细胞周期和染色质的重要组成部分相关基因CCNB2和MCM3在ES患者中的关键作用。本文由深圳市人民医院临床医学研究中心戴勇主任课题组和洪小平主任课题组合作发表。

实验设计

分组：ES患者/健康捐赠者（各一名）

样本类型：脐带血

实验方法：sc-ATAC-seq

研究结果

1.sc-ATAC-测序的质控概述

研究人员使用Chromium平台(10× Genomics）通过sc-ATAC-seq技术研究了健康捐赠者和18 syndrome (Edwards综合征，ES)三体患者的脐带血单细胞染色质可及性的差异。过滤掉细胞碎片和线粒体污染后，得到11611个脐带血单核细胞(NC组6315个;ES组5296个细胞)。从NC_CBMC 和 ES_CBMC数据可以看到2倍以上（相对于远端的序列片段）的序列片段被富集到了TSS的附近，说明测序捕获的片段大多分布于无核小体的开放区域。利用双端reads信息计算了每个样品的文库insertion size distribution，平均而言，27.8 × 103个独特的片段被比对在了核基因组中，来自于所有细胞中的约38.1%的Tn5片段中出现在聚合谱的峰内，这个比例可与出版发布的ATAC-seq配置文件相比较。

        图1 sc-ATAC-测序及质控

2.脐带血主要免疫细胞单细胞染色质可及性分析

使用Cell Ranger ATACsc-ATAC-seq对从NC和EC组获得的11611个细胞进行UMAP降维聚类，共确定了13个细胞聚类。利用已经被报道过的细胞Marker基因网站(http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/index.jsp)映射确定了13个细胞聚类的6种免疫细胞类型：T细胞，B细胞，单核细胞/树突状细胞(DC)，自然杀伤细胞(NK)、祖细胞和巨核细胞红系(ME)。利用MS4A1, CD79A和CD79B基因启动子细胞特异性基因鉴定B细胞，ITGAX、CD36、和IL3R1基因启动子细胞特异性基因鉴定单核细胞/树突状细胞，GZMB和NKG7基因启动子细胞特异性基因鉴定自然杀伤细胞，LEF1基因启动子细胞特异性基因鉴定T细胞，PECAM1基因启动子细胞特异性基因鉴定祖细胞，KIT, CD36, CD38基因启动子细胞特异性基因鉴定巨核细胞红系。在确定了6种细胞类型及NC、ES各组细胞的组成比例后，发现在ES组中B细胞、祖细胞和巨核细胞红细胞明显增多，而自然杀伤(NK)细胞、T细胞和单核细胞/树突状细胞(ES)明显低于NC组。不同细胞类型的peaks的差异分析结果暗示ME细胞群和祖细胞群在ES患者的发育中起着重要的作用。

图2  18三体综合征脐带血单核细胞景观

3.MC细胞中人T细胞白血病病毒1感染通路紊乱

研究人员鉴定获得267个ME细胞，ME细胞的比例在ES和NC组中分别为0.461(244/5296)和0.035(22/6315)。对ME细胞进行了进一步的UMAP降维聚类再分群分析，ME0和ME1的比值在ES组和NC组中并没有显著性差异，差异peaks基因分析表明179个peaks基因特异性表达于ME0细胞，418个peaks基因特异性表达于ME1细胞。ME0中共获得了472个差异显著的peaks基因(上调89个，下调383个，p < 0.05， |log2FC| > 1) ，ME1中共获得938个peaks基因(270个上调，668个下调，p < 0.05)，GO富集分析表明，这些差异表达的基因与磷酸化负调控、蛋白质磷酸化负调控等生物学功能有关。ME-0的差异基因被富集在人类T细胞白血病病毒1感染通路中，ME-1的差异基因被富集在凋亡通路。

图3 ME细胞亚群分析

4.MCM3和CCNB2在祖细胞中的下调

脐带血中含有大量的干细胞，包括造血干细胞和大量其他的干细胞，统称为脐带血干细胞/祖细胞。研究人员一共捕获了538个祖细胞，其中，ES组500例，NC组38例。差分分析后，总共获得1070个peaks基因，获得的基因中有43个peaks基因表达显著上调，131个峰表达显著下调(p < 0.05, log2FC > 1)，896个peaks基因无差异显著性。为了获得染色质可及性区域的关键基因，研究人员使用cytoHubba程序Cytoscape(3.8.0)计算得到核心基因(top10，MCC /degree)：Fos、 mdm2、 mcm3、 kpna2、ccnb2、rbck1、asb7、NUP107、POLR2A、 VPRBP。为了进一步研究ES疾病的分子特征，进一步对该细胞进行了UMAP降维聚类再分群分析。与NC组相比，P0和P1细胞在ES组中减少，P2细胞比例增加。

这三种细胞亚群在ES组和NC组差异分析表明在P0中有233 个差异显著的peaks基因，164个下调(P < 0.05, log2FC <−1)和69个上调(P < 0.05, log2FC > 1)

(图4D)。在P1中有343个差异显著的peaks基因，27个下调(P < 0.05, log2FC <

−1)和336个上调。只有15个差异peaks基因在P-0和P-1细胞群体中表达，表明P-0和P-1是两种不同的祖细胞。GO富集分析表明P0细胞群的差异peaks基因主要富集在有丝分裂细胞周期阶段的转变的调控，细胞周期阶段的调控、

RNA聚合酶II基转录因子结合和其他途径。

   图4 祖细胞亚群分析

总结

研究人员通过对来源于一名ES患者和一名健康捐赠者的脐带血细胞进行sc-ATAC-seq分析，在脐带血中分析得到13个细胞聚类，通过Marker基因鉴定将13个细胞聚类确定为6种免疫细胞类型。其中，B细胞、祖细胞、ME细胞

ES组显著高于NC组，自然杀伤细胞(NK)、T细胞和单核细胞/树突状细胞(ES)

ES组细胞显著低于对照组。在ME细胞和祖细胞中发现了数百个差异peaks基因，

提示祖细胞和ME细胞可能在ES疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。对ME细胞再分群分析结果差异分析，结果表明ME-0的差异基因被富集在人类T细胞白血病病毒1感染通路中，ME-1的差异基因被富集在凋亡通路。对祖细胞再分群分析结果差异分析，结果表明P0细胞群的差异peaks基因主要在有丝分裂细胞周期阶段的转变的调控，细胞周期阶段的调控、RNA

聚合酶II基转录因子结合和其他途径发挥重要调控作用。

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杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组及最新的单细胞测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近50篇，影响因子平均15+。

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