单细胞悬液计数时候的这些“暗雷”你留意到了吗？|单细胞专题

在进行细胞悬液活率计数的时候，通常使用的方法有两种，一种是台盼蓝染料(Trypan Blue)，另一种是AO/PI染料，两种染料原理不同，所以各有优劣，下面为大家简单介绍：

台盼蓝机理：

正常的活细胞，胞膜结构完整，生物膜的选择透过性能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，选择透过性丧失，台盼蓝可以进入到细胞膜内，将细胞染成蓝色。

通常认为如果细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。

图1：台盼蓝染色示意图

AO/PI机理：

细胞染色液由AO（吖啶橙，绿色荧光染料）和PI（碘化丙锭，红色荧光染料）混合而成。两者均是是可对DNA染色的细胞核染色试剂。PI不具有膜透过性，只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，但是AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核。当两种染料同时存在于细胞核中，PI通过荧光共振能量转移引起AO荧光的减少。因此，在荧光场中，活细胞的细胞核中仅有AO的存在所以发绿色荧光，被计为活细胞，而细胞膜受损的有核细胞中既有AO又有PI，但是红色荧光盖过了绿色荧光，故被计为死细胞。

图2：AO/PI染色示意图

台盼蓝与AO/PI的性能比较

图三：台盼蓝VS AO/PI

在通常情况下，两者染料的计数结果其实并不会差异很大，但是在一些特殊情况下，会出现某种染料不适用的情况

一、台盼蓝染色遇到细胞是本身带色素的时候，比如动物的黑色素瘤、皮肤、吸烟人群的肺等组织，植物茎、叶、花果实的有色素外皮等组织，活细胞的颜色也会因为色素存在显得非常暗，对台盼蓝染色后的细胞判定会出现较大的干扰，会使得计数得到的活率比实际活率低

二、AO/PI染料在遇到一些本身带荧光素的物种组织的时候，例如一些海洋生物例如水母、节肢动物例如部分昆虫，荧光场下可能会呈现有些细胞既是红色又是绿色的情况，导致活细胞的密度加上死细胞密度会大大超过总细胞密度，呈现极其不科学的数值结果。

三、另外一种特殊情况，在遇到一些不规则的细胞类型时，比如神经细胞，肌细胞时，因为细胞呈现长条状或者梭形，若是使用计数仪进行计数时，由于计数仪默认的圆度规则不能准确计算这些细胞的数量，会引起计数结果的很大误差，可以对计数仪的圆度规则进行参数自定义或者使用台盼蓝进行肉眼计数。

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