【用户文章】植物顶级期刊-单细胞测序揭示拟南芥离体叶片根从头再生机制 | 单细胞专题
期刊名称：Plant Communications（IF：8）
发表时间：2022.2
样本类型：拟南芥叶片
组学技术：10x单细胞转录组测序
单位信息：中国科学院植物生理生态研究所（上海）
创伤后，许多植物器官能够通过 “新根再生”（DNRR）的过程再生优质根，这一过程被广泛应用于许多农业技术。
叶片外植体在贴附后能感知许多早期信号，包括伤口信号、胁迫信号、环境信号和叶片的发育状态。在这些早期信号的引导下，生长素产生并运输到损伤区域内的再生竞争细胞中，使得根器官发生。
茉莉酸盐（Jasmonate，JA）已被鉴定为促进叶片外植体DNRR的伤口信号之一。叶片脱落后JA迅速积累，JA介导的双向信号通路直接激活AP2/EREBP转录因子家族基因ERF109的表达。在叶片脱落后约10分钟，ERF109通过上调参与生长素生物合成的基因来促进DNRR发生。
生长素是关键的细胞命运控制激素，在DNRR期间将早期信号与细胞命运转换联系起来。当生长素极性转运到再生能力强的细胞中时，生长素信号通路直接激活转录因子WOX11的表达，以实现从再生能力强的细胞到根创始细胞的命运转变。
但是关于这些由创伤诱导生成的激素和化学物质以及应激和环境信号是如何在离体叶片的DNRR中发挥作用，目前尚未可知。
1. DNRR转录组研究策略
作者进行了延时和单细胞 RNA-seq 实验，使用已经建立的拟南芥叶片不定生根系统来表征DNRR中的高分辨率转录组框架（图 1 A-1D ）。
切下第一对莲座叶，将脱落的叶子在不添加激素的B5培养基上培养。通常，每片叶外植体的损伤区再生1-3个不定根，在B5培养基上6 d后根尖可见。每个延时 RNA-seq 实验都包含两个生物学重复。
图1A-D 实验概述
为了研究早期信号的转录调控，作者在叶片分离后0、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和12小时使用全叶外植体进行转录组测序（图1B）。
通常，伤口和应激信号等早期信号在许多细胞中发挥作用，包括叶缘细胞、叶肉细胞、一些维管细胞和伤口部位的细胞。GO富集显示转录组重新编程以响应早期信号（图1E）。
图1E GO富集通路图
为了关注再生过程中基因的表达水平，将在t 0时转录水平不可检测或非常低，但在叶片脱落后的任何时间点与T0时相比转录水平显著增加的基因作为候选基因进行进一步的分析（图2）。
作者认为这些候选基因可能是早期伤口信号反应基因，它们在脱离前很少参与正常的叶片发育，并在脱离后被激活用于再生。
其次，为了研究不定根器官发生中的转录组重编程，作者在分离后的t0、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和5 d对叶片外植体的损伤区域进行了延时RNA-seq分析。再生活性细胞位于受伤区域的脉管系统中，它们通常在脱离后5天内经历命运转变，形成根原基。
除了再生能力强的细胞外，受伤区域的许多其他细胞也可能对为根器官发生提供细胞环境很重要。在本实验中，将叶片外植体培养在B5培养基（mock）或含有生长素极性运输抑制剂naph乙基邻苯二甲酸（NPA）的B5培养基上，以揭示生长素介导和非生长素介导的基因表达谱。NPA处理可以阻止再生活性细胞中生长素的积累，导致根系器官无法正常。
上调和下调基因的GO富集（图1F）显示了不定根器官发生期间的转录体编程。为了关注再生，选择t0时转录水平不可检测或非常低以及t0后任何时间点（图4、5和6）转录水平增加的基因为候选基因进行进一步分析。在DNRR中，这些基因可能在脱细胞前参与正常叶片发育，并在叶片外植体的损伤区域被激活。
第三，作者在单细胞水平上进行了转录组测序以研究在促进根器官发生过程中，叶片外植体损伤区域的转录因子谱（图1D）。分离后第4天收集叶片外植体的损伤区域，用于单细胞提取和RNA序列分析（图7）。在这个时间点可以观察到受伤区域的细胞混合，包括在不同阶段经历细胞命运转变的细胞。
这是因为不同外植体之间的生根效率和速度并不完全同步，因此叶片外植体在不同的命运转变阶段含有细胞。此外，因为每个叶外植体可以连续产生一到三个不定根，所以它可能包含处于命运转变不同阶段的细胞。
2. 延迟RNA转录组测序绘制早期信号转录图谱
从T0到12小时（图1B），Col-0的整个脱落叶片中早期信号激活的候选基因可以根据其表达模式分为六个基因簇（图 2 A-2F）。基因簇 1（图2A）和 2（图2B）从分离的 10 分钟到 1 小时被激活，然后被下调。基因簇 3 和 4 逐渐被激活并在分离后 1 小时出现峰值表达，随后急剧下调（基因簇 3；图2C）或逐渐下调（基因簇 4；图 2 D)。
基因簇 5 在叶片脱落后逐渐激活，在 2-8 小时表达高峰，之后下调（图2E）。基因簇 6 在 1 小时后以各种模式持续上调（图2F）。参与 DNRR 伤口反应的ERF109和ABR1分别位于基因簇 1 和 3 中，表明这两个 ERF 家族基因在不同时间发挥作用促进 DNRR（图 2 A 和 2C）。
图2 响应早期信号激活的候选基因
对基因簇 1 至 6 中的基因进行GO富集分析（图 2 G）。JA、乙烯和 ROS 通路中的基因在叶片脱离后立即被激活，表明除 JA 外，乙烯和 ROS 还可以作为 DNRR 期间对叶片脱离的快速响应的伤口信号。
此外，许多膜相关和细胞壁相关的通路被激活，表明膜和细胞壁状态的调整可能是应对创伤、压力和环境变化所必需的。基因簇6包括一些代谢途径中的基因，包括花青素生物合成（图 2 G）。花青素生物合成基因的上调可以解释为什么在 B5 培养基上的 DNRR 期间叶片外植体变成紫色（图1A）。
这些数据表明参与伤口信号通路、应激反应、亚细胞调节和代谢通路的基因可能在 DNRR 期间上调。
3. JA 介导的伤口信号通路在 DNRR 中的作用
作者比较了从0到 12 小时 Col-0 和coi1-2的全叶外植体之间的转录组，以分析 JA 在伤口反应中的作用（图 1B）。首先检查了JA生物合成途径中的基因。一组JA生物合成基因在脱离后10-30分钟内迅速上调，其在coi1-2中的表达水平低于Col-0（图3A），表明正反馈参与了JA生物合成的调控和信号通路。
接下来分析了叶片脱离后不同时间点的所有六个基因簇。在 1 小时发现一个峰值，显示 Col-0 中的激活基因富集，但coi1-2中没有（图3B），表明这些基因通过 JA 信号通路上调。
这些基因的 GO 分析表明，除了 JA 途径外，许多应激和创伤反应途径在脱离后 1 小时也受到 JA 信号传导的影响（图 3C）。启动子顺式元件的分析表明 AP2/ERF 家族转录因子可能参与 JA 介导的这些基因的激活（图3D）。因此，除了在 DNRR 期间促进生长素产生外，JA可能在许多途径的调节中充当关键的伤口反应激素
图3 JA、乙烯和ROS在DNRR中的信号传递作用
4. 乙烯和活性氧作为伤口信号促进 DNRR
与模拟对照中的叶外植体相比，脱离后用乙烯处理短时间（6 小时或 24 小时）的叶外植体表现出增强的生根能力（图3E和3F）。
先前的研究表明，ROS 可以在受伤后迅速产生，用 ROS 抑制剂水杨酰羟肟酸 (SHAM) 或谷胱甘肽(GSH) 处理降低了叶外植体的生根能力（图3 E和3G）。这些结果说明ROS 在调节插条中不定根形成中的作用
为了进一步分析 ROS 在叶片外植体 DNRR 中的作用，作者进行了基于甲磺酸乙酯(EMS) 诱变的遗传筛选，以鉴定可以挽救由 SHAM 处理引起的生根缺陷的抑制突变体。一种候选抑制突变体的基于图谱的克隆揭示了SUPERROOT 1 ( SUR1 ) 基因中的突变（图 3 H），导致突变体中生长素的过度积累。抑制子 sur1-21突变体在 SHAM 处理下表现出挽救的生根能力（图3）。
这通过向培养基中添加生长素得到证实，这部分挽救了由 SHAM 处理引起的 Col-0 叶外植体的生根缺陷（图3J）。因此，ROS 可能通过与生长素的串扰参与 DNRR。
总之，这些数据表明，除 JA 外，乙烯和 ROS 还可以作为伤口信号来促进受伤后的 DNRR。
5. 不定根器官发生过程中转录组重编程的延时 RNA-seq 分析
从0到5 d（图1C）在模拟对照（未经 NPA 处理的 Col-0）的叶片外植体受伤区域中激活的候选基因基于它们的表达模式可以分为六个基因簇（基因簇 7 到 12；图 4 A-4F 4）。基因簇 7（图 4A）和 8（图4B）在 6 到 12 小时的转录水平峰值被激活，然后被下调。
基因簇 9（图 4 C）和 10（图 4 D）逐渐被激活，并在 1 至 3 天显示出峰值转录水平。基因簇 11 (图 4E) 在 3 天前表现出低转录水平，并在 3 天后上调。在这些延时分析中，基因簇 12（图 4 F）不断上调。对基因簇 7 至 12 的 GO 分析表明，多个途径被激活，包括与转录、激素、细胞壁、应激反应、发育和运输相关的途径（图 4 G）。根据在器官发生、伤口诱导再生和插条资源分配方面的生物学功能（图 4 H），作者进一步分析了从六个基因簇中选择的候选基因（图 4 A-4F）。
扦插研究表明，在不定根再生过程中，资源分配存在严格的营养和代谢控制，包括在扦插的茎基部建立碳水化合物库,以及扦插茎基部的铁积累。
在延时 RNA-seq 数据中，确定了许多参与资源分配的基因（图 4 H）。这一结果也得到了 GO 分析概述的支持，该分析表明许多参与资源运输的基因在 DNRR 期间被上调（图1F）。
研究结果表明，在 DNRR 期间，叶片外植体的受伤区域中激活了参与器官发生、伤口诱导再生和插条资源分配的多个基因。
图4 不定根器官发生过程中的转录图谱分析
6. DNRR过程中生长素控制的基因
为了分析 DNRR 中的生长素调控，作者比较了从 t 0到 5 天的模拟对照和 NPA 处理之间叶片外植体受伤区域的基因转录水平（图1C ）。许多候选基因（图 4 H）在NPA处理后不被激活或激活程度较低（图 5 A），表明生长素可能是 DNRR 的主要调节因子。
生长素几乎不影响例如TOSL2、PYL s、PER s、SWEET s、NRT和NAC s（图 5A）等基因的激活，表明它们可能被非生长素途径激活。说明在DNRR过程中也可能需要非生长素途径来协助。
接下来分析了叶片分离后不同时间点的基因簇7到12，发现模拟和NPA处理在叶片分离后第4天和第5天的基因转录水平存在显着差异（图5B），表明生长素介导的基因激活主要发生在这段时间。GO 分析证实，除了生长素相关途径外，生长素还调节发育、细胞壁相关和 ROS 相关途径（图 5 C）。
图5生长素控制基因激活
7. 叶片外植体损伤区的单细胞RNA序列分析
基于 Col-0 叶片在分离后4天受伤区域的单细胞数据（图1D），聚类到了19个细胞簇（图 6A）。作者基于已发表的标记基因和启动子融合GUS报告系对细胞簇进行了注释（图 6 A-7J）。细胞簇 12 与木质部细胞密切相关，细胞簇 6 代表束鞘细胞。细胞簇 11、18、1 和 9 与韧皮部细胞相关，韧皮部伴生细胞和筛分标记改变韧皮部发育( APL )（图 5 D 和 6E ）。细胞簇 16 和17可能代表分裂细胞，观察到许多组蛋白基因和CYCLIN基因在这两个簇中富集（图6 F）。
细胞簇 15 似乎表现出与创伤相关的基因表达（图6G）。细胞簇 10 代表气孔，细胞簇 3、5、7、13 和 14 可能代表叶肉细胞，因为这些细胞表达了许多参与光合作用的基因。细胞簇0和8可能与表皮细胞有关。总体而言，细胞簇分析反映了分离叶中存在的原始组织。
图6 离体叶片损伤区的单细胞图谱
8. 不定根器官发生的单细胞 RNA-seq 分析
之前已经证明不定根是由脉管系统中的再生能力细胞启动的，WOX11和LBD16分别是不定根形成细胞和根原基的标记基因。对脉管系统和分裂细胞中WOX11和LBD16表达模式的分析表明，这两个标记基因在细胞簇 1、12、16 和 17 中高度富集。因此，进一步分析这四个细胞簇，鉴定出10个细胞亚簇（图6K）。
细胞亚群 2 与原始叶外植体中的原菌相关并表达原菌标记基因，例如 AP2 样转录因子基因AINTEGUMENTA ( ANT )和受体样激酶基因（图6K）。细胞亚群 0 可能与原始叶外植体中的木质部细胞相关，并且富含木质部细胞标记基因At5g05960（图 6B）、AAP6和XND1（（图 6K）。III 类同源域-亮氨酸拉链 (HD-Zip III) 家族基因ATHB8，在木质部薄壁细胞和原菌木质部侧子细胞中表达在分离后 4 天的叶片外植体受伤区域，主要富集在细胞亚群 0 和 8 中（图6K）。
细胞亚群3可能与原始叶外植体中的韧皮薄壁组织细胞有关，它表达了标记基因SWEET11 (图 6 K )。细胞亚群 7、8 和 9 可能与分裂细胞有关，因为许多组蛋白和CYCLIN基因在这些亚群中富集（图6 K）。
根创始人细胞标记WOX11在细胞亚群 0、2、6和 8 的一些细胞中表达（图6 L）。WOX11在细胞亚群 2 中的表达与先前研究的发现一致，即根形成细胞可以由原形成层形成。表达根原基标记LBD16的细胞主要位于细胞亚群 4、5 和 6 内的区域中（图6L）。ERF115在细胞亚群 6 中高度富集。
总之，细胞亚群分析的结果提供了有关原始叶外植体受伤区域组织中基因表达模式的信息，以及参与不定根器官发生的细胞。
分离的拟南芥叶片可以再生不定根，为研究新根再生（DNRR）提供了一个平台。本文提供了 DNRR 中从创伤反应到根器官再生全过程中转录组重编程的高分辨率图谱，展示了 DNRR中涉及的关键因素。
在叶片离体后12小时内对叶片进行延时RNA测序 (RNA-seq)，结果显示茉莉酸、乙烯和活性氧 (ROS) 通路在受伤后迅速被激活。研究证明乙烯和活性氧可作为创口信号以促进DNRR发生。
再对叶片离体5天内进行延时RNA测序，结果显示不定生根过程中脱离叶片受伤区域的器官发生、伤口诱导再生和资源分配相关基因的激活。此外，单细胞RNA转录组数据揭示了不定生根期间离叶受伤区域的基因表达模式。
总体而言，本研究不仅提供了转录组相关信息，还揭示了拟南芥离体叶片中DNRR发生的关键因素。
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