植物单细胞样本制备，你不知道的细节（文末有彩蛋） | 单细胞专题

目前植物单细胞转录组研究主要分为两类：一类是对原生质体进行测序，另一类是对植物细胞核进行测序。这就涉及到原生质体分离技术（PI, protoplast isolation）和植物细胞核分离技术（PN，plant-nuclei isolation）。

一、植物原生质体制备

植物细胞受到一层细胞壁的保护，为植物单细胞（原生质体）制备造成了障碍，研究人员需要根据植物组织的特性，设计合理的酶选择和实验方案。动物细胞之间的黏连主要依靠细胞外基质（ECM，Extracellular matrix）的连接来实现，植物细胞之间的黏连则主要是依靠细胞壁来建立，所以，去除细胞壁是制备植物单细胞悬液的关键。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶（图1），果胶主要集中在胞间层（Middle lamella），有助于将相邻细胞黏连在一起；纤维素主要集中在初生细胞壁和次生细胞壁，承担骨架功能。总体来说，只要有效去除细胞壁中的纤维素和果胶，就可以实现原生质体的制备。

图1 植物细胞壁结构

为了去除细胞壁中的纤维素和果胶，可以选用纤维素酶和果胶酶进行溶解，两种酶的特性如下：

1）纤维素酶：是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，将纤维素从大分子多糖水解为单分子。此外，纤维素酶还有木聚糖酶的活力，作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。纤维素酶的活性在pH4.5-6.5时达到最大，mg2+对酶的活性有激活作用，活性容易受到植物细胞的酚类化合物的抑制。

2）果胶酶：能催化果胶解聚，或者催化果胶分子中的酯水解，以破坏细胞壁，涉及到聚甲基半乳糖、醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶等混合酶。果胶酶的活性在pH3.0时达到最大，Ca2+对酶的活性有刺激作用，Fe3+和Cu2+对酶的活性有抑制作用。

单一的纤维素酶或果胶酶对于细胞壁额水解能力并不强，通常是以混合酶的形式应用的，一般以终浓度1.5%（w/v）纤维素酶和0.1%（w/v）果胶酶混合进行的，也有专门的这两种混合酶制品，或者像纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10和果胶酶Y-23这些酶组合物进行原生质体的制备。

原生质体制备方案

 Source：Bargmann BO, et al.（2010）

1、准备植物材料

1) 不同植物和组织原生质体制备方法略有差别，需要使用正确的消化混合酶。因此在进行全面实验之前，建议先对材料进行小规模消化，以评估组织原生质体制备效率，酶的组成等，并估计阳性细胞百分比。

2) 在phytatrays（Sigma）中的尼龙网上（250μm，NITEX）上水培幼苗（下图左），使根生长进入生长培养基（0.22％w / v MS培养基、1％w / v蔗糖，0.05％w / v MES、KOH调pH 至5.7）。或者植物在垂直放置的1％琼脂平板上的尼龙网（100μm筛网）上生长（下图右）。

2、准备酶溶液

1) 在软化水中溶解1.25% w/v纤维素酶（Yakult）、0.3% w/v 混合酶（Yakult）、0.4M D-甘露醇、20 mM MES和20 mM KCl并使用1M Tris/HCl（pH 7.5）调节pH到5.7。这种方案配置的溶液会出现略微混浊的现象。

2) 将溶液加热至55°C 并保持10分钟（溶液变澄清），然后冷却至室温，再加入0.1% w/v BSA（牛血清白蛋白），10 mM CaCl2和5mM β-巯基乙醇。

3、制备原生质体

1) 用手术刀将生长幼嫩的根从尼龙网上切下来，然后放入到装有原生质体溶液的烧瓶中。通常每1500个幼苗根使用10ml原生质体溶液。

2) 烧瓶置于摇床中，室温下轻轻摇动烧瓶（75rpm）一小时。注意较长的孵育时间可以增加原生质体产量，但也会增强对原生质体基因表达的影响。

3) 用40μm细胞过滤器（BD Falcon）过滤原生质体溶液，并将溶液分配到15ml锥形管（BD Falcon）中。

4) 在离心机中以500g离心10分钟。（离心速度取决于所用原生质体的类型、脆性和酶处理过程中产生的细胞碎片的量）。

5) 除去大部分上清液，将原生质体重悬于剩余溶液中，显微镜检查原生质体。

6) 利用血细胞计数器估算原生质体的数量和密度。

扫一扫观看原生质体制备视频（英文版）

 Source：Ryu KH, et al.（2019）

使用含30％（v / v）漂白剂、0.1％（v / v）Triton X-100的溶液对拟南芥种子进行表面灭菌10分钟，并在覆盖有100/47um筛网的MS培养基上培育（16L/8D）。发芽5天后，切下初生根尖，放入直径35毫米的培养皿中，培养皿中包含70μm滤网和4毫升酶溶液（1.25％（w / v）纤维素酶（“ONOZUKA”R-10，Yakult）、0.1％（w / v）果胶酶（P-3026，Sigma-Aldrich）、0.4mM甘露醇、20mM MES（pH 5.7）、20mM KCl、10mM CaCl 2、0.1％（w / v）BSA）。培养皿在恒温摇床中25℃、85rpm摇动1小时，然后将细胞溶液以500g离心10分钟，并将沉淀重悬于500μL清洗溶液（0.4mM甘露醇，20mM MES（pH5.7），20 mM KCl，10mM CaCl2，0.1％（w / v）BSA）。将原生质体溶液通过70 μm滤网过滤，然后使用40 μm滤网过滤两次。将过滤的溶液以200g离心6分钟，将沉淀的原生质体用30-50μL清洗溶液重悬，以达到所需的细胞浓度（大约104原生质体/ml）。

Source：Birnbaum K, et al.（2003）

幼苗在琼脂平板上的尼龙网中垂直生长。6日龄幼苗的根尖端切下约1厘米，用解剖刀片切成大块，参考Birnbaum等人（2003年）的方案制备7ml原生质体溶液：新鲜的原生质体缓冲液（0.1M KCl、0.02M MgCl2、0.02M CaCl 2、0.1％BSA（Sigma Aldrich）、0.08M MES和0.6M甘露醇，并用0.1M Tris HCl调节至pH 5.5）使用前与1.5％纤维素酶R-10和0.1％果胶酶（Duchefa Biochem）充分混合。根组织置于原生质体缓冲液中后，在设定为200转/分钟的恒温摇床中20℃保持晃动2小时。随后将混合物通过100mm尼龙过滤器过滤，并用1-5ml根原生质体缓冲液冲洗。然后将原生质体离心10分钟（500g，4℃），轻轻除去上清液，将沉淀重悬于含有0.4M甘露醇但不含CaCl2的10ml根原生质体缓冲液中。再次重复洗涤过程，原生质体如前所述离心，并重悬于含有0.4M甘露醇、不含CaCl2的~500ul或更少的原生质体缓冲液中。在光学显微镜下检测原生质体，如果需要，通过另外的洗涤步骤除去任何多余的碎片或未原生质化的组织。将细胞通过40mm细胞过滤器（过滤，使用血细胞计数器计数，并调节原生质体密度至约800-900个细胞/ ml。

参考文献

1. Bargmann BO, et al. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. 2010 Feb 18;(36):1673.

2. Ryu KH, et al. Single-Cell RNA Sequencing Resolves Molecular Relationships Among Individual Plant Cells. Plant Physiol. 2019 Apr;179(4):1444-1456.

3. Birnbaum K, et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 2003 Dec 12;302(5652):1956-60.

二、植物细胞核制备

  以拟南芥根的细胞核制备为例

1、材料

试剂耗材
生长7天的拟南芥根	40μm细胞滤器（康宁，货号：07-201-430）	200μl移液管
细胞核分离buffer(NIB)	30um MACS细胞滤器（美天旎，货号：130-098-458）	1000μl 宽口滤芯枪头
60毫米圆形培养皿	摇床（Thermo Fisher，货号：13-687-704）	1000μl滤芯枪头
医用镊子	50ml 带有螺旋盖的Faclon管	1000μl 移液管

NIB（Nuclei isolation buffer）配方

a) 500μl CelLyticTM PN分离/提取缓冲液MilliporeSigma，货号：CELLYTPN1

b) 1.5ml RNAse-free水

c) 使用前新鲜配置

2、操作流程

①　将500μl NIB培养基加入到一个新的、无菌的、预冷的60mm培养皿中；

②　从7天生的拟南芥植株（图1A）中收集新鲜幼嫩的根：用剃须刀片将根从植株的地上部分分离出来；

③　用镊子将根转移到60毫米的培养皿中（图1B），确保根浸润到NIB培养基中（注意不要有植物地上部分残留）；

④　用剃须刀把根切碎，约切5分钟；

⑤　如果需要，可以额外添加NIB培养基以保持根组织湿润（图1C）；

⑥　在摇床上4℃孵育15分钟；

⑦　50毫升的Faclon管置于冰上，3 0上套40μm滤器后安装在管口；

⑧　在过滤核悬液之前，先用500μl NIB对滤器进行预湿。将管稍微倾斜 （图1D）；

⑨　使用宽口枪头慢慢吸取切碎的根/NIB混合物到预湿的滤器上；

⑩　使用宽口枪头吸取500μl NIB，慢慢冲洗培养皿收集剩余细胞核；

⑪　吸取冲洗液加入到滤器上进行过滤。

图1

3、流式分选纯化（可选）

1）目的

尽量减少细胞器对拟南芥根细胞核悬浮液的污染，清除其他污染物（如细胞碎片），并防止10×仪器启动捕获细胞时出现管道堵塞。

2）材料

试剂耗材
过滤收集的细胞核悬液	1ml宽口枪头（Rainin）	离心机
PBS+（PBS+RNAse抑制剂和BSA）	20-250μl枪头（Rainin）	带细胞滤器扣盖的试管（Corning Falcon，货号：08-771-23）
1 mg/ml碘化丙啶（Alfa Aesar，货号：J66584）	20-250μl宽口枪头（Rainin）	细胞分选仪：BD FACSAria II /BD FACSMelody/Beckman Coulter MoFlo Astrios
1ml Eppendorf管	20μl枪头（Rainin）
1ml枪头（Rainin）	35um Flow tubes

3）PBS+配方

①　3.9 ml不含钙镁离子的PBS(Corning, 货号：21-040-CV)；

②　20μlRNase抑制剂，4u /μl（Roche，货号：03335399001），终浓度0.2 U/μl；

③　80 μl超纯BSA，50mg/ml（Thermo Fisher Scientific，货号：M2616)），终浓度0.1%（w/v）；

④　使用前新鲜配置。

4）操作流程

①　分选前将BD FACSAria II型细胞分选仪的样品室和分选收集装置预冷至4℃；

②　将200μl过滤后的细胞核转移到一个流管中，通过其滤帽作为一个非染色对照（作为细胞核分选的基线）；

③　用碘化丙啶（10μg/ml终浓度）对剩余样品进行染色；

④　分选前置于冰上10min；

⑤　分选样本，分选仪使用100 nm喷嘴，默认压力为20 psi；

⑥　用488 nm激光器激发碘化丙啶，并使用600 nm高通滤波器和610/20nm带通滤波器组合检测；

⑦　收集已分选的细胞核，置于15ml锥形管中，加入1ml PBS+后置于冰上；

⑧　分选结束后4℃ 1000g离心10min（此步骤和后续步骤需要去掉缓冲液中的二价离子）；

⑨　去上清后添加3ml PBS+，轻轻重悬细胞核（为了防止核膜渗漏，强烈建议用轻旋法而不是移液法来重悬细胞核。在荧光显微镜下，碘化丙啶或DAPI染色可以很容易地检测到受损的细胞核，但是离散泄漏无法检测到）；

⑩　4℃ 1000g离心10min；

⑪　去上清后添加30-100μl PBS+，轻轻重悬细胞核；

⑫　使用血细胞计数板和强光显微镜检测细胞核浓度，必要时调节PBS+体积。

4、Countess II自动细胞计数仪计算细胞核密度

1）材料

0.4%台盼蓝染料

Countess II自动细胞计数仪

Countess II FL载玻片

1 ml Eppendorf管

10 μl枪头（Rainin）

2）操作流程

①　使用200μl 带滤网宽口枪头将9μl核悬浮液转移到新的试管中；

②　加入1μl 0.4%台盼蓝；

③　轻弹试管进行混合，避免细胞核聚团；

④　在CountessTM II FL载玻片上滴加10μl 细胞核悬液；

⑤　选择直径在2-15μm之间、台盼蓝阳性的细胞核，计算细胞核浓度。

参考文献

Thibivilliers S, et al. Isolation of Plant Root Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. Curr Protoc Plant Biol. 2020 Dec;5(4):e20120.

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