用户文章-STTT｜生酮饮食通过改变肠道菌群减少结肠3型先天淋巴细胞（ILC3）缓解结肠炎|代谢组学专题

标题：Ketogenic diet alleviates colitis by reduction of colonic group 3 innate lymphoid cells through altering gut microbiome发表日期：2021年4月发表期刊：Singal Transduction and Targeted Therapy影响因子：18.187研究团队：同济大学附属第十人民医院、复旦大学上海医学院、美国贝克曼研究所技术手段：16S rRNA基因测序、非靶代谢组、转录组测序01

KD有助于结肠炎诱发前

小鼠肠道有益菌群

和相关代谢物

首先，在诱导结肠炎之前，测定正常饮食（ND）、生酮（KD）、低碳水化合物（LCD）饮食干预16周后，对小鼠粪便微生物群及菌群代谢物的影响（图1a）。各组微生物情况分析显示，KD、LCD和ND组菌群构成存在明显区别（图1d）。门水平上（图1e），KD和LCD组的厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）比率和变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度高于ND组。属水平上（图1f），阿克曼氏菌属（Akkermansia）和罗氏菌属（Roseburia）在KD组更丰富。LEfSe分析进一步显示颤螺旋菌属（Oscillibacter）在LCD组中富集，而阿克曼氏菌属（Akkermansia）、罗氏菌属（Roseburia）和瘤胃球菌（Ruminococcaceae）在KD组富集（图1g）。通过GC-MS和UHPLC-HRMS/MS测定不同饮食下小鼠粪便菌群代谢物。结果显示，三组代谢物间存在明显区别，其中26种有显著差异，根据其浓度分布分为两组，包括在LCD中（如对苯二甲酸、甾胆素）和 KD/ND（如L-天冬酰胺、乙醇酸）占主导地位的代谢物簇（图1h）。热图证明了细菌和代谢物之间直接关联（图1i）。这些结果表明，相对于ND，定量诱导生酮可以有效地改变肠道微生物群和代谢物。

图1

02

KD控制体重增加

并改变小鼠的代谢状态

进一步对结肠炎诱导前后，各组小鼠的体重和血清代谢物变化情况进行研究。结果显示，结肠炎诱导前，LCD促进小鼠体重增加，而KD组和ND组之间无明显的体重差异（图2a），结肠炎诱导后，LCD-C组的脂肪重量明显高于KD-C或ND-C组（图2c、d），肝脏脂肪囊泡结果类似（图2e，f）。对血清代谢物检测，KD组的血清葡萄糖水平显着低于LCD或ND组（图2g），而血清3-羟基丁酸（BOH）水平显着升高（图2h）。表明LCD显著促进体重增加，而KD显著改变结肠炎诱导前后小鼠的葡萄糖和BOH代谢。
图203KD减轻炎症并保护DSS诱导的结肠炎小鼠的粘膜屏障功能对各组结肠炎诱导小鼠的炎症情况进行检测。各组诱导结肠炎后的小鼠的存活曲线如图3a所示。此外，LCD-C组的小鼠更容易出现血便和结肠缩短，KD-C组的小鼠血便最少，结肠延长（图3b，c）。与ND-C组相比，KD-C组小鼠的体重减轻，疾病活动指数（DAI）评分下降（图3d、e），H&E染色显示肠上皮炎症细胞浸润减少（图3f，g），且降低了血清脂肪酶（LPS）水平（图3h），而LCD-C组则相反。接着作者通过免疫荧光和免疫组化检测结肠组织中屏障相关蛋白，以评估KD和LCD对结肠炎小鼠屏障功能的影响（图3i，3j）。与ND相比，KD显著增加肠上皮中Occludin、ZO-1和MUC-2的表达，而LCD则相反。PAS染色显示，KD和LCD分别增加和减少了结肠中杯状细胞的数量（图3k）。
图3
04KD和LCD影响DSS诱导的结肠炎小鼠的粘膜炎症和免疫

为研究KD或LCD介导的结肠炎和屏障功能变化的潜在机制，作者进行了结肠炎诱导后KD、LCD和ND结肠组织的转录组测序（每组n = 3）。

确定了1643个差异基因（图4a）。GO分析显示，这些基因可能参与炎症反应、免疫系统过程、免疫反应、脂多糖反应和中性粒细胞趋化性（图4b）。同时预测了前20个基因之间的相互作用（图4c）。通过PCR验证受KD或LCD影响的炎症相关84个关键基因的表达（每组n = 4），结果显示LCD-C与KD-C组中15个候选基因上调（图4d），涉及两种粘膜炎症和免疫相关通路：ILC3效应细胞因子（包括 IL-17α、IL-22 和 IL-18）和单核细胞趋化因子（包括 Ccl4 和 Ccl12）（图4e）。PCR证实KD-C和LCD-C组结肠组织的IL-22、IL-17α、IL-18和Ccl4表达分别低于和高于ND-C组（图4f）。免疫荧光表明LCD-C和ND-C组比KD-C组的结肠上皮富含更多RORγt ⁺ CD3 ^- ILC3细胞（图4g，h）。

综上所述，作者发现炎性细胞因子、趋化因子和ILC3细胞是KD抑制结肠炎的靶点。

图4
05

来自 KD 和 LCD

喂养小鼠的FMT影响结肠炎

诱导GF小鼠的炎症发展和屏障功能

探究结肠炎诱导后，KD和LCD对小鼠肠道菌群的影响。16S rDNA测序结果显示，三组之间存在明显差异（图5c，d）。在门水平上（图5e），KD-C组中的变形菌（Proteobacteria）明显少于ND-C组，LCD-C组中的Proteobacteria多于ND-C，疣微菌（Verrucomicrobia）情况相反。在属水平上（图5f，g)，KD-C富含阿克曼氏菌（Akkermansia），而LCD-C组富含大肠杆菌/志贺氏菌（Escherichia/Shigella）。

图5
06

来自 KD 和 LCD

喂养小鼠的FMT影响结肠炎

诱导GF小鼠的

炎症发展和屏障功能

为了验证KD或LCD的影响是否依赖于肠道菌群，将KD、LCD或ND喂养小鼠的肠道菌群移植至结肠炎GF小鼠（FKD-C、FLCD-C 和 FND-C）。实验过程中FKD-C无小鼠死亡；而FLCD-C组有2例死亡，FND-C组有1例死亡（图6a）。FLCD-C组体重减轻明显快于FKD-C和FND-C组（图6b）。与FND-C组相比，FKD-C组结肠更长，粘膜炎症更低（图6c，d），DAI分数分别降低（图6e）。屏障相关分子Occludin和ZO-1的表达显著升高（图6f，g），杯状细胞增多（图6h），而FLCD-C组相反。

图6接着研究了饮食治疗小鼠的FMT是否影响炎症反应或粘膜免疫。发现与FND-C组相比，FKD-C组血清LPS水平较低，FLCD-C组较高（图7a），而免疫荧光表明，FKD-C组结肠上皮富集更少的RORγt ⁺ CD3 ^- ILC3细胞，其中大部分集中在隐斑中（图7b、c）。qRT-PCR表明FKD-C组结肠组织的IL-17α、IL-18、IL-22和Ccl4 mRNA水平显着低于FND-C组，FLCD-C组结果相反（图 7d )。粪便微生物测定证实了三组的微生物群存在属之间的显著差异，包括那些在FKD、FLCD和FND 组中占优势的菌群（图7e）。详细分析显示，从ND微生物群成功转移的OTU占供体整个群体的98.0 %，而来自KD和LCD微生物群的OTU分别占92 %和93 %。这些结果表明，很大一部分OTU成功定植于受体小鼠的肠道，表明FMT的可靠性。图7

总结

这项研究中，作者比较了生酮饮食（KD）、低碳水化合物饮食（LCD）和正常饮食（ND） 喂养的小鼠，肠道菌群和代谢物的变化，通过使用硫酸葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎性结肠炎动物模型进行了一系列系统研究。研究了KD对炎症、肠道微生物组、粘膜屏障和免疫力的影响。具体而言，通过16S rRNA基因测序、液相色谱-质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）分析粪便样品，通过代谢检测试剂盒分析血清样品。在验证实验中使用无菌小鼠，通过转录组测序、RT-PCR、组织病理学和免疫荧光分析结肠组织。最后，在无菌（GF）小鼠模型中进行粪便菌群移植（FMT），阐明了KD修饰的肠道菌群对肠道炎症的有益作用。最终研究结果表明，KD 是一种很有前途的肠道炎症饮食疗法，并证明了其对肠道菌群的调节作用。

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