应用系列之：10-20分单细胞研究是怎么做的？|单细胞专题
联川近期集中推出单细胞应用系列，以杂志影响因子（IF）为衡量标准，对不同IF的杂志的单细胞文章进行归类和整理，解析了不同层次的单细胞研究是如何开展的。上期我们发布了应用系列之：5-10分单细胞研究是怎么做的？，本期我们继续升华揭秘10-20分单细胞研究是怎么做的？
在10-20分单细胞研究中，主要涉及到不同领域的细胞图谱、发育和细胞功能机制的研究，是开展单细胞研究非常经典的套路！下面我们一起来围观10-20分单细胞研究是怎么做的？
一、单细胞RNA-Seq揭示VSIR-/-小鼠银屑病皮肤巨噬细胞的转录图谱和异质性
发表期刊：Theranostics
影响因子：11.556
发表时间：2020.3
研究内容：作者使用ImQ对野生型和VSIR-/-小鼠的右耳和剃背皮肤进行连续5天的治疗，建立银屑病样皮炎模型。然后，利用10x Genomics技术对小鼠背部皮肤进行单细胞测序。
样本数量：2个
样本类型：野生型和VSIR-/-小鼠银屑病皮肤组织
实验方法：单细胞转录组测序
实验设计：见下图
作者通过单细胞RNA测序研究了野生型和VSIR-/-小鼠银屑病皮肤组织，进一步对皮肤组织的细胞类型进行鉴定，随后，作者分别对巨噬细胞和树突细胞的异质性进行分析，再将这两种细胞的表达谱进行差异分析，最后作者对皮肤中成纤维细胞的转录谱进行分析，分析其中的表达差异。
研究结果：作者从23258个细胞中确定了12个主要的细胞亚型。皮肤细胞主要有巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞。WT组(61.29%)和VSIR-/-组(77.7%)以巨噬细胞为主。值得注意的是，在VSIR-/-银屑病小鼠中，DC和成纤维细胞是增加的。此外，对基因表达特征进行了评估，观察到Hspb1和CEBPB在VSIR-/-银屑病小鼠中显著上调。差异基因表达和GO分析揭示了区分这些亚群的特定基因表达模式，并揭示了每种细胞类型的假定功能。数据分析导致在VSIR-/-小鼠中发现了一些与银屑病相关的新基因。
文章评价：这篇文章首次通过单细胞转录组测序分析了揭示了VSIR-/-小鼠银屑病皮肤组织的巨噬细胞的转录图谱与表型异质性，为V区免疫球蛋白T细胞激活抑制因子在皮肤银屑病中的作用机制提供了研究参考。
参考文献
Qie C, et al. Single-cell RNA-Seq reveals the transcriptional landscape and heterogeneity of skin macrophages in Vsir-/- murine psoriasis. Theranostics. 2020 Aug 21;10(23):10483-10497.
二、通过单细胞测序确定心脏发育过程中瞬时基因表达情况
发表期刊：Developmental Cell
影响因子：12.270
发表时间：2016.10
研究内容：通过单细胞转录组学技术构建了人类尿液的单细胞图谱
样本类型：小鼠心脏
实验方法：单细胞转录组测序
实验设计：见下图
作者在小鼠胚胎的不同发育阶段取到心脏样本进行单细胞测序，对细胞进行分类鉴定。最后通过得到的数据分析作者确定了确定了源自干细胞的心肌细胞的发育年龄，并验证了转录因子Nkx2-5单倍体不足的谱系特异性后果。
研究结果：作者首先在小鼠心脏发育的不同阶段和腔室中分离了1200多个单细胞进行单细胞转录组测序鉴定了具有不同基因表达谱的心肌细胞亚群，得到了非心肌细胞、心房心机细胞、心室心机细胞的发育转录调控程序。最后作者对干细胞衍生的心肌细胞发育年龄进行鉴定，并发现当NKX2.5 表达水平对于不同心脏谱系的成熟具有重要作用。
文章评价：心脏从最开始子宫内的一根管不断发育形成芽珠状的硬块，再通过自动折叠最终变成四腔结构。在这一个严丝合缝的程序当中是如何保证不出差错，本文作者通过对小鼠胚胎不同发育阶段心脏的单细胞图谱构建阐明了基因和细胞功能种类的变化是如何调控心脏。
参考文献
DeLaughter DM, et al. Single-Cell Resolution of Temporal Gene Expression during Heart Development. Dev Cell. 2016 Nov 21;39(4):480-490.
三、单细胞转录组分析揭示了人体肠道中不同的营养吸收功能
发表期刊：Journal of Experimental Medicine
影响因子：14.307
发表时间：2020.2
研究内容： 通过单细胞RNA-seq揭示人体肠道中细胞构成及其不同的营养吸收偏好
样本类型：人回肠、结肠和直肠上皮
样本数量：6例肠肿瘤患者
研究方法：scRNA-seq
实验设计：见下图
本文对来自人类回肠、结肠和直肠的上皮组织进行单细胞RNA-seq，分析了14,537个上皮细胞，比较了不同肠段的细胞类型、标记基因以及营养吸收偏好，通过定量PCR、免疫荧光和功能分析验证了其中一些见解。同时比较了人类和小鼠回肠之间细胞景观的共同特征和差异特征，并为人类TA细胞和杯状细胞鉴定了潜在的新标志物。
研究结果：
本文对来自人类回肠、结肠和直肠的14,537个上皮细胞的单细胞RNA-seq分析揭示了小肠和大肠中不同的营养吸收偏好，表明大肠中存在潘氏样细胞（PLC），并确定了潜在的人类瞬时扩增细胞和杯状细胞的新标记基因。此外，作者还揭示了人类三个肠段中每种细胞类型的转录组变异，以及人类和小鼠回肠之间相同细胞类型的变异。为详细表征人类肠道细胞的构成和功能提供了基础，有助于更好地了解人类肠道疾病，如炎症性肠病和肠道肿瘤的发生。
文章评价：这项研究中，使用单细胞RNA-seq首次以单细胞分辨率调查了人类回肠、结肠和直肠上皮的基因表达谱。揭示了这些部分营养吸收的不同功能，并证实了大肠中PLC的存在，并发现了人和小鼠之间不同的基因表达模式。这些结果为更好地了解人类肠道细胞的构成和功能以及进一步研究小肠结肠炎和肠道肿瘤的发生提供了基础。
参考文献：
Wang Y, et al. Single-cell transcriptome analysis reveals differential nutrient absorption functions in human intestine. J Exp Med. 2020;217(2):e20191130.
四、利用单细胞转录组测序技术鉴定人类尿液中的肾脏祖细胞
发表期刊：Protein Cell
影响因子：14.870
发表时间：2021.4
研究内容：通过单细胞转录组学技术构建了人类尿液的单细胞图谱
样本数量：12名健康成人
样本类型：尿液
实验方法：单细胞转录组测序
实验设计：见下图
作者采集了14名健康成人50-100mL自流尿液进行单细胞转录组测序，分离检测了2200个细胞，最终分析了1010个细胞。通过对数据的聚类分析，作者得到了7个不同的细胞簇，并对其进行身份注释。作者对得到的单细胞进行了细胞周期分析，检测了尿液中是否存在具有肾脏再生能力的祖干细胞
研究结果：文章绘制了首个成人尿液单细胞图谱。作者对鉴定到的细胞进行细胞周期分析发现多种免疫细胞和上皮细胞可能在健康成人的尿液中增殖和发挥功能。SOX9是多种组织中干细胞或祖细胞群体的标志物，作者从尿液中鉴定到表达SOX9的细胞并成功通过人-鼠嵌合肾系统进行培养以及功能验证。
文章评价：本文思路清晰，文字简练，工作翔实。不仅绘制了第一个成人尿液细胞图谱，还开发了一个用于培养肾祖肝细胞的方法，为肾脏再生培养研究夯实了基础。
参考文献
Wang Y, et al. Single-cell RNA-Seq analysis identified kidney progenitor cells from human urine. Protein Cell. 2021;12(4):305-312.
五、单细胞核RNA-seq识别多核骨骼肌纤维的转录异质性
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.919
发表时间：2020.12
研究内容：通过单细胞核RNA测序（snRNAseq）来确定多核骨骼肌纤维内细胞核多样性特征，揭示了小鼠在出生后发育以及衰老的肌肉中会出现独特的肌核种群，以及基因表达信息。
样本类型：小鼠胫骨前肌或比目鱼肌
样本数量：单只小鼠（出生后5个月、24个月、30个月），2只小鼠(出生后21天，P21)，4只小鼠（出生后10天，P10)，P10和P21多个样本分别混合成1个样本以收集足够的核进行测序
研究方法：snRNA-seq（单细胞核测序）
实验设计：见下图
作者对来自小鼠出生后10d、21d、5、24、30个月的胫骨前肌或比目鱼肌的细胞核进行10x Genomics的核标记，对各阶段的snRNA-seq数据进行了整合
分析。系统地研究了随时间推移的肌细胞核转录特征，并确定整个生命周期中细胞核组成的模式，阐明某些细胞核被分配到共享肌纤维细胞质中的特殊隔间的机制。
研究结果：
1. 通过snRNA-seq对5个月龄小鼠骨骼肌细胞核进行分析，得到8331个核数据，聚类结果中显示了骨骼肌中预期的所有主要细胞类型，包括肌细胞核、卫星细胞、纤维脂肪祖细胞(FAP)、内皮细胞、平滑肌细胞、腱细胞和免疫细胞。通过典型标记基因(包括Pecam1 (内皮细胞)、Myh11 (平滑肌)、Dcn (FAPs )、Mkx (腱细胞)和Ptprc (免疫细胞)的表达来识别非肌细胞核簇。
2. 骨骼肌在功能退化和再生衰退方面存在年龄相关的变化，接下来作者研究衰老过程是否影响了肌核转录。从24月龄和30月龄的胫骨前肌提取了18,087个细胞核。仅在30月龄的肌肉中，观察到5月龄或24月龄不存在的新出现的肌核群，包括分别表达Nr4a3、Ampd3和Enah的簇。
3. 作者整合了5月龄、24月龄和30月龄的肌细胞核，发现了一致的衰老相关基因表达特征，包括两个老化时间点的Nr4a3和Smad3的上调。Smad3与肌肉老化过程有关，而Nr4a3对代谢适应运动有作用。腓肠肌中Nr4a3的smRNA FISH证实，老年肌肉中的Nr4a3+肌细胞核表达增高。表明这可能是衰老肌肉的一个渐进特征。
4. Ampd3+群体显示肌源性调节因子Myf6、促萎缩基因Fbxo32和神经肌肉标记物Musk、Chrnb1和Hdac4的存在。该群还富集了与免疫反应、凋亡和蛋白酶体降解相关的基因(Tnfrsf23、Traf3和Psma5)。综上所述，这些数据表明Ampd3+群体可能代表一种失神经状态，即功能失调。
5. Enah+肌核簇被发现与P21肌肉的Enah+肌节组装状态高度相似，有许多共同的标记基因，包括Atf3、Flnc和Nrap。30月龄的Enah+簇的存在进一步证明了这种肌节群在整个生命周期中的出现，在发育和衰老过程中表现最为显著。
文章评价：本研究的snRNA-seq成功地捕获了肌细胞核多样性，同时也发现了所有年龄段的转录状态。技术层面，采用核测序而非细胞测序，解决了成熟肌细胞由于多核化造成的细胞直径偏大而难以被单细胞平台捕获的问题（≤40um）。研究内容层面，一方面样本代表性强，收集了各个发育阶段的肌细胞核样本，有助于深度解析时间依赖的肌核动力学机制；另一方面对测序数据中新发现的肌细胞类群和分子表达特征进行了后续验证实验，如单分子RNA荧光原位杂交，qRT-PCR，细胞干扰实验等。需要对以前未被确认的细胞类群进行功能验证，这将是未来研究的重点。总之，本文是单细胞测序在骨相关研究领域不可多得的模范式的研究案例，值得学习！
参考文献：
Petrany MJ, et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nat Commun. 2020 Dec 11;11(1):6374.
六、单细胞RNA-seq揭示了小鼠动脉粥样硬化中主动脉巨噬细胞的转录景观和异质性
发表期刊：Circulation Research
影响因子：17.367
发表时间：2018.6
研究内容： 对低密度脂蛋白受体缺陷（Ldlr−/−）或载脂蛋白缺陷（Apoe−/−）小鼠分为两组：正常喂食组和高脂高胆固醇喂食诱导动脉粥样硬化模型组，取主动脉解离单细胞并通过FACS分选出CD45+细胞，进行单细胞RNA测序。探究了免疫细胞及巨噬细胞亚型在正常和动脉粥样硬化的不同功能和分子表达特征。
样本类型：主动脉细胞分选出CD45+细胞
样本数量：Ldlr−/−，正常喂食组（n=9，喂食11周），高脂高胆固醇喂食组（n=8，喂食11周；n=7，喂食20周）；Apoe−/−，高脂高胆固醇喂食组（n=10，喂食12周）。各组小鼠主动脉分离的细胞各自混合在一起，以便于分选足够的CD45+细胞.
研究方法：scRNA-seq
实验设计：见下图
对Ldlr−/−或Apoe−/−小鼠分别正常喂食和高脂喂食，取小鼠主动脉分选CD45+细胞进行单细胞RNA测序。无监督聚类出了13个不同的主动脉细胞群，在健康和动脉粥样硬化的主动脉中发现了驻留样巨噬细胞，而另外2种巨噬细胞群、单核细胞和单核细胞来源的树突状细胞几乎只在动脉粥样硬化主动脉中检测到。差异基因分析和GO富集分析分别揭示了3种巨噬细胞亚群和单核细胞来源的树突状细胞的特定基因表达模式和细胞的功能。本研究探究了在正常和动脉粥样硬化小鼠模型中免疫细胞及巨噬细胞亚型的不同功能和分子表达特征。
研究结果：
1. 单细胞测序数据经过低质量过滤，最终得到1236个高质量细胞(正常组372；病变组854)。无监督聚类得到13个不同的主动脉细胞群，通过标记基因注释出髓系和淋巴系细胞类群。
2. 巨噬细胞是动脉粥样硬化主动脉中最大的免疫细胞群，占CD45+细胞总数的28.9%。巨噬细胞分类为炎症性细胞(47.0%)、Res样细胞(34.4%)和TREM2hi巨噬细胞(18.6%)。
3. 炎症性巨噬细胞表达一些促(如Ccl3、Il1b、Il1a、Nlrp3、Cebpb、Egr1、和Phlda1)/抗(Zpf36和Nr4a1)动脉粥样硬化的基因，也表达巨噬细胞激活抑制的几种基因(如Nfkbiz、Nfkbid和Ier3)。Res样巨噬细胞表达了与先前主动脉驻留巨噬细胞相似的基因(F13a1和Lyve1)、趋化因子(Ccl24和Ccl9)，以及与M2型巨噬细胞相关的基因(Folr2、Cbr2和Mrc1)。TREM2hi巨噬细胞则显示出一种独特的基因表达特征，如Cd9、Spp1(编码骨桥蛋白)、Hvcn1和组织蛋白酶(Ctsd、Ctsb和Ctsz)。
4. 对三种巨噬细胞高表达的基因进行GO分析显示，均涉及到炎症反应、髓系白细胞活化等相关功能。然而，TREM2hi巨噬细胞含有其他2个群体中没有的特定功能，如有机物和细胞分解代谢过程、脂质代谢过程、胆固醇外排调节和氧化应激等。本次研究中证实了TREM2hi群作为以前未被报道的巨噬细胞群体的存在。
5. MoDC/DC作为动脉粥样硬化相关的主要细胞群，占动脉粥样硬化主动脉中CD45+细胞总数的14.9%，具有典型的巨噬-树突细胞功能特征。
6. Ldlr−/−(20周喂食)和Apoe−/−(12周喂食)小鼠动脉粥样硬化模型，均显示出炎症性巨噬细胞、Res样巨噬细胞、TREM2hi巨噬细胞和MoDC/DC的富集，表明这些细胞在晚期动脉粥样硬化中的具有一定的功能。
7. 对重度颈动脉狭窄（>70%）病人的动脉内膜切除术获得了颈动脉组织，进行了免疫组化，证实了小鼠动脉粥样硬化模型中的巨噬细胞亚群，以及基因产物均可在人类病变组织中检测到。
文章评价： 这项研究主要聚焦在动脉粥样硬化模型的细胞和分子功能，解释疾病的机制。确定了免疫细胞中巨噬细胞各种亚型的存在，以及在分子水平的特征。单细胞测序技术可以实现免疫细胞的分类和检测基因表达情况，非常完美地契合了作者的研究意图。该研究是非常经典的单细胞技术在动脉粥样硬化模型中的应用案例，建议仔细品读！
参考文献：
Cochain C, et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals the Transcriptional Landscape and Heterogeneity of Aortic Macrophages in Murine Atherosclerosis. Circ Res. 2018 Jun 8;122(12):1661-1674.
七、单细胞RNA-seq分析揭示人类骨关节炎的进展
发表期刊：Annals of the Rheumatic Diseases
影响因子：19.103
发表时间：2018.7
研究内容：通过单细胞RNA测序研究了控制骨关节炎发病机制的分子程序和谱系进展模式，确定了软骨细胞的新亚型新标记
样本类型：关节软骨组织
样本数量：10例接受膝关节置换术的骨关节炎患者（不同疾病阶段S0-S4）
研究方法：scRNA-seq（STRT）
实验设计：见下图
本文取了不同疾病进程的OA患者软骨样本，通过单细胞转录组测序，得到了软骨细胞图谱，系统分析了不同疾病阶段的软骨细胞类型，细胞周期，与疾病进程相互关系，同时使用严重性指数和对应分析研究了 OA 景观的转录程序与临床结果之间的关系。
研究结果：
本文在人类 OA 软骨中鉴定了七个分子定义的软骨细胞群，包括四个凭经验定义的群体：ProCs、preHTCs、HTCs、纤维软骨细胞（FCs）和三个具有不同功能的新表型：效应软骨细胞（ECs）、调节软骨细胞（RegCs）和稳态软骨细胞（HomCs)。
以单细胞分辨率呈现了不同OA阶段的基因表达谱。同时发现了增殖性软骨细胞（ProCs）、肥大前软骨细胞（preHTCs）和肥大软骨细胞 (HTC) 之间的潜在转变，并在 HTC 内定义了一个新的细分亚群。揭示了软骨祖细胞（CPC）的新标记，并使用计算分析证明了CPC与纤维软骨细胞之间的关系。
最后，通过RT-qPCR及ROC曲线分析，分析了有利基因和不利基因，得出了关于临床结果的预测指标，并阐明了不同细胞类型在OA早期诊断和治疗中的作用。
文章评价：文章用明确的标记物揭示OA软骨细胞的新表型，完善了现有的分类，同时样本设置了不同OA阶段，很好的展示了不同阶段细胞变化和疾病进程间的关系，最后通过疾病严重程度的划分，分析了OA单细胞转录组结果与临床结果之间的关系。
参考文献：
Ji Q, et al. Single-cell RNA-seq analysis reveals the progression of human osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2019 Jan;78(1):100-110.
八、单细胞RNA-Seq分析鉴定半月板前体细胞并揭示半月板退变的进程
发表期刊：Annals of The Rheumatic Diseases
影响因子：19.103
发表时间：2019.12
研究内容：作者使用单细胞RNA测序来鉴定不同的半月板细胞亚群，并探讨半月板退变的机制。
样本数量：6个
样本类型：健康人半月板组织 退变病人半月板组织
实验方法：单细胞转录组测序
实验设计：见下图
作者首先使用单细胞转录组测序用于鉴定健康人和退变的半月板细胞中的细胞亚群及其基因特征，以确定它们的分化关系，并表征特定细胞类型内的多样性。随后采用集落形成、多向分化实验和小鼠半月板损伤模型对半月板前体细胞进行鉴定。采用计算分析和实验验证的方法研究了退变的半月板祖细胞(DegP)细胞团在半月板退变过程中的作用。
研究结果：作者在健康人的半月板中发现了七个cluster，包括五个经验性定义的群体和两个新的群体。拟时序分析显示内皮细胞和纤维软骨细胞前体细胞(FCP)存在于拟时序轨迹起始处。黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM)/CD146在两个cluster中高表达。CD146+半月板细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化并形成集落。作者鉴定了退行性半月板细胞簇比例的变化，发现了具有祖细胞特征的退行性半月板特异性细胞cluster。4个祖细胞群的重建表明，FCP向DegP的分化是一个异常过程。白介素1β刺激人半月板细胞可增加CD318+细胞，而转化生长因子β1可抑制退变半月板细胞中CD318+细胞的增加。
文章评价：作者首次通过单细胞转录组测序鉴定出了半月板前体细胞，揭示了半月板退变的新机制，为半月板退化提供了新的潜在的治疗策略。
参考文献
Sun H, et al. Single-cell RNA-seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration. Ann Rheum Dis. 2020 Mar;79(3):408-417.
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