ATVB：单细胞测序揭示人主动脉瓣图谱和钙化性疾病机制 | 单细胞专题
期刊名称：Arteriosclerosis Thrombosis And Vascular Biology
影响因子：10.514
发表时间：2020年12月
发表单位：华中科技大学和布朗大学
所用组学：Single-cell RNA sequencing
今天这篇文章通过单细胞转录组测序探究主动脉瓣小叶中细胞的异质性--钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)的细胞起源，分类和复杂的细胞病理学分化过程，构建健康和CAVD临床标本中人主动脉瓣细胞图谱。本文是由布朗大学沃伦.阿尔伯特医学院和华中科技大学联合发表，下面是对本文的详细解读。
目的
小叶增厚、纤维化和硬化是钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)的早期病理特征。对参与病理过程的主动脉瓣细胞的不充分认识可能会影响治疗策略的发展。本文的目的是在健康和冠状动脉病变的临床标本中构建人类主动脉瓣细胞图谱，为了解冠状动脉病变的细胞起源和复杂的细胞病理分化过程提供线索。
方法
应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术评估了从6种不同人类主动脉瓣叶分离的细胞进行细胞异质性的研究，以验证正常、健康的瓣膜与CAVD患者之间的差异。结合染色、原位定位等验证实验和单细胞转录组分析，提供了内皮细胞向间质转化参与主动脉瓣叶病变增厚的证据。
结果
本研究应用scRNA-seq评估了CAVD和健康样本主动脉瓣叶分离出来的细胞异质性，并进行了细胞、原位定位等实验，以验证正常、健康的瓣膜与CAVD患者之间的差异。通过比较健康和CAVD标本，本文鉴定出14种细胞亚型，包括3种不同异质性的瓣膜间质细胞亚群、3种免疫源性细胞亚群、2种瓣膜内皮细胞亚群和6种特别是在CAVD小叶中发现的新的瓣膜源间质细胞亚群。单细胞测序提供了主动脉瓣细胞图谱，并提示了驻留细胞亚群之间新的功能。对不同亚群特异性细胞标记物的鉴定揭示了健康和钙化主动脉瓣的驻留细胞异质性。拟时序分化和验证实验证明内皮细胞向间质转化参与了主动脉瓣叶的钙化增厚的形成。
钙化主动脉瓣疾病(CAVD)是心血管疾病的第三大病因，在65岁以上人群中占比约为25%。虽然CAVD的病因尚不明确，但推测其可能是环境因素和遗传因素共同作用的结果。因为CAVD呈现出多个病理阶段，且其发生涉及到一个复杂的多层组织结构，具有丰富的细胞外基质表型和一个独特的高可塑性的多能常驻细胞群体。因此，确定病理组织中存在的细胞亚群可能有助于了解病因和治疗方案。
主动脉瓣叶由两种已知的细胞类型组成，一种是瓣间质细胞(VICs)，另一种是瓣内皮细胞(VECs)。最近的一系列报告表明，VICs具有细胞异质性，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞和干细胞等。然而，组成人类主动脉瓣的所有细胞的异质性阻碍了研究各种细胞类型在CAVD发生和进展中的作用。
目前关于瓣膜钙化的观点认为其来源于原生VICs的分化。然而，最近发现的瓣膜祖细胞可能也参与了诱发CAVD的形成。此外，其他研究表明间质细胞群可能也与钙化主动脉瓣的发育有关。由于每个细胞亚群都有不同的分子特征，传统的全基因组方法的应用受到疾病进展过程中瓣膜细胞组成多样性的限制，这可能掩盖了单个细胞群的相关变化。而使用荧光激活细胞分选(FACS)和基于候选标记基因的Cre-loxP谱系追踪也具有一定的局限性。例如，FACS需要事先了解在疾病过程中表达可能改变的细胞表面标记物，而Cre-loxP谱系追踪依赖于使用成熟的转基因小鼠作为适当的疾病模型。单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)的出现促进了对组织样本中细胞群的鉴定，以及无需建立已知表面标记基因和新细胞群的鉴定。这为评估健康和疾病状态下单个细胞群体中基因表达的异质性提供了可能。
为了评估CAVD发生期间细胞类型的变异和发育，本研究对来自CAVD患者的主动脉瓣叶和来自于接受手术后患者的正常主动脉瓣组织进行了scRNA-seq分析。本研究旨在解决关于瓣膜生物学和疾病发病机制等方面的问题。首先，通过单细胞聚类分析是否可以定义瓣膜细胞类型，使用已知标记基因识别新的细胞表型，并完善现有的细胞分类。其次，本研究确定了单细胞分析技术是否可以帮助解析人类CAVD形成的潜在机制。第三，通过一系列的生信分析和细胞实验构建了细胞差异分化轨迹，并确定内皮细胞向间充质转化(Endo - MT)在CAVD中的关键作用。
6个样本经过scRNA-seq分析，共得到31043个细胞进入后续分析（图1），6例标本在外观上有显著差异，2例健康标本呈透明膜状，4例CAVD标本呈明显硬结节。组织学染色显示CAVD标本较健康标本增厚（图2）。此外，CAVD标本组织中的驻留细胞数量明显高于健康标本组织。比较6个标本t-SNE的聚类分析结果显示，2个健康标本的细胞散点分布一致，而4个CAVD标本表现出显著的差异性（图1D）。通过单细胞测序检测到了14种细胞亚型，包括3种不同异质性的瓣膜间质细胞亚群、3种免疫源性细胞亚群、2种瓣膜内皮细胞亚群和6种在CAVD小叶中发现的新的瓣膜源间质细胞亚群（图1E）。健康标本的细胞主要由VICs亚群组成，这些亚群高表达了此前证实的VICs标志物COL1A1和COL3A1，证实了主动脉瓣炎的主要的驻留细胞是VICs。通过免疫组化及免疫荧光分析显示，并非所有分离的VICs都表达FOS、HSPA6和SPARC（图 3D）。此外，局部原位免疫组化染色将3个makers标记到主动脉瓣组织的3层结构，包括海绵层(Spg)、纤维层(Fbs)和心室层(Vet)（图3F）。这些阳性标记物，主要分布于Spg而非Fbs和Vet（图3G）。FOS和SPARC在Spg和Fbs中均高表达，而HSPA6在Spg中高表达，这些结果表明，3个VICs亚群主要分布在主动脉瓣叶的Fbs和Spg，HSPA6标记的VICs倾向于定位于Spg。
图1：主动脉瓣(AV)存在细胞异质性
图2：单细胞测序后的细胞聚类散点图和染色镜检
图3：瓣膜间质细胞(VICs)是异质性的
通过聚类分析可知，CAVD聚类1、2、3、4、6、8和12为显著的细胞群；簇1、2、3、4、6和8是新的细胞类型，与之前鉴定的VEC或VIC不完全匹配。因此，我们将这些细胞鉴定为VDSCs（图4）。基因表达分布热图清晰的显示，LUM、SOX4、CCL20、MT1A、RPL17、CMSS1在新鉴定的细胞簇中均有表达。免疫荧光标记结果显示，CAVD小叶的所有标记物的阳性染色率较高。LUM、SOX4、CCL20、MT1A、RPL17和CMSS1的荧光信号分布在Spg和Fbs中。这些结果表明新细胞群主要集中在CAVD主动脉瓣叶间质层。
图4：钙化主动脉瓣病变中出现的细胞
为了确定新鉴定的细胞类型与发育状态的关系，作者对经scRNA-seq鉴定得到的单细胞进行了拟时序分化轨迹分析，确定这些细胞匹配了11种发育状态，有5个潜在的差异分支点（图5A）。并进一步的对每组细胞进行了KEGG及GO功能注释，确定了细胞差异的分子机制，结果表明，不同的细胞群体表达了不同的基因集，KEGG代谢通路主要富集于有丝分裂细胞周期的G1/S转变；高尔基膜和核苷酸结合。
由于健康主动脉瓣标本主要包含VICs和VECs两种细胞类型，作者推测新发现的VDSCs(簇1、2、3、4、6、8)可能来自于VICs和VECs的分化。因此，本研究进行了拟时序分析，结果显示，虽然VIC聚类(7、10、13)与处于过渡状态的新出现的细胞聚类(1、2、3、4、6、8)重叠，但许多VIC的轨迹时序属于聚类7、10、13，这些聚类在健康主动脉瓣中大量分布（图3）。VIC比VDSCs分化更早。这一结果表明，存在于健康主动脉瓣中的VICs可以分化VDSCs，并参与主动脉瓣叶的钙化增厚。
此外，根据拟时序分析，聚类2和4位于分化终止，聚类1、3、6和8处于中间过渡态，且簇12的状态最接近簇11，但大多数簇12细胞与簇1、簇3、簇6和簇8的细胞一起处于中间过渡状态。作者发现簇12是表达VEC标记物SELE、IL1RL1和PI3的细胞群，可能是一种从VEC过渡到间质细胞的细胞类型。因此，基于不同scRNAseq鉴定的细胞簇的分化和发育状态，作者推测CAVD的发生可能伴随着Endo - MT。VEC簇11和12和VIC簇7、10和13的伪时间子集在5个细胞群中显示了11种分化状态（图5B）。簇11处于分化状态的开始阶段，簇10处于分化状态的结束阶段，簇7和簇12分散在过渡状态（图4B）。在钙化主动脉瓣组织中，免疫荧光显示SELE表达（红色箭头），而IL1RL1很少出现在间质中，SPARC在间质层的表达明显（图5G），这间接验证了簇12的存在，表明Endo - MT在主动脉瓣钙化和增厚过程中扮演重要角色。
图5：拟时序分化揭示CAVD过程中内皮间充质转变(Endo - MT)
为了确认Endo- MT是否参与了CAVD的形成，荧光原位杂交显示，瓣膜内皮层边缘明显可见IL1RL1+/SPARC+和SELE+/SPARC+细胞（图6A）。免疫荧光试验证实SELE+/SPARC+细胞存在于亚内膜区域，倾向于从内皮区迁移到间区，且存在间质转变现象（图6A）。此外，该实验表明VEC培养中CD31+/COL1+；SELE+/COL3+；SELE+/SPAR+共表达传递状态细胞为间充质细胞（图6B）。这些结果证实了VECs确实存在Endo- MT。
通过Bulk RNA测序，发现典型间充质标物的上调以及内皮基因的下调现象（图6E）。途径富集分析表明，ECM受体相互作用，局灶性粘附，PI3K-Akt信号通路与Endo-MT高度相关；C11orF96，COL1A1， IFI27，HES4， CNN1在VEC(12d)中表达高于0d的VEC，并且CAVD样本中表达高于健康样品（图6K和6L）。综上所述，Endo-MT参与钙化主动脉瓣小叶增厚。
图6：Endo-MT参与CAVD形成过程的验证及机制研究
本研究提供了主动脉瓣小叶的驻留细胞图谱，并确定了CAVD的致病轨迹。这些发现可能有助于指导旨在抑制CAVD进展的新型细胞基础治疗策略的识别和开发。
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