【Nature Medicine】单细胞测序解析转移性胃腺癌的异质性和谱系多样性 |单细胞专题
论文标题：Single-cell dissection of intratumoral heterogeneity and lineage diversity in metastatic gastric adenocarcinoma
刊登日期：2021年1月
发表杂志：Nature Medicine
影响因子：87.241
研究机构：德克萨斯安德森癌症中心
摘要
瘤内异质性(Intratumoral heterogeneity,ITH)是癌症的一个基本特征，但目前对ITH的起源仍知之甚少。本文作者对20例胃腺癌 (gastric adenocarcinoma,GAC)患者的腹膜转移瘤进行了单细胞转录组分析，构建了包含45,048个细胞的转移瘤图谱，通过分析肿瘤细胞群的转录组状态，深入探索了恶性转移瘤细胞的瘤内异质性，并确定其与患者生存显著相关。作者从转录、基因、分子和表型水平揭示了转移瘤标本中肿瘤细胞的谱系多样性，并认为这种多样性是ITH的主要成因。作者根据单细胞分析结果将转移瘤标本分为两种亚型，其预后预测独立于临床指标，并在多个大规模胃腺癌队列中找到了由12个基因组成的预后标记。
背景介绍
胃腺癌是一种预后差、死亡率高的常见癌症，往往诊断出来已是晚期，且具有耐药性。胃腺癌一个常见的转移部位是腹腔（peritoneal carcinomatosis,PC），目前针对晚期患者的治疗手段有限，只有一小部分患者对免疫检查点阻断或HER2靶向治疗有效，可效果也只是短暂的，改进治疗方法迫在眉睫。目前TCGA将原发性胃腺癌分为四种基因型，但对于晚期转移性胃腺癌的分子分型认知有限，在临床中，经验主义盛行，患者未能有序分类，极大限制了合理治疗方案的实施。
胃腺癌具有广泛的肿瘤异质性和瘤内异质性，后者是肿瘤细胞生存的基础，往往导致治疗耐药性，成为改善患者预后的主要障碍。但目前对瘤内异质性的起源了解甚少。因此，深入剖析其细胞/分子基础将影响胃腺癌治疗策略。本文利用单细胞转录组测序(scRNA-seq)这件利器，构建了腹膜转移瘤细胞的单细胞图谱，展示了腹膜转移瘤的异质性，并确定其与患者生存显著相关。
材料方法
样本信息：冷冻保存的晚期胃腺癌患者的PC细胞：20例（长期和短期生存者各10例）
实验方法：scRNA-seq（10x Genomics平台；Illumina NovaSeq6000）
主要分析内容：
结果1：胃腺癌腹膜转移瘤（PC）的单细胞转录组图谱
首先，作者对20例冷冻保存的晚期胃腺癌患者的PC细胞进行了scRNA-seq，长期和短期存活患者各10例，所有患者的原发肿瘤均为弥漫性，且未见微卫星不稳定性，(图1a)。经过质量过滤后，45,048个细胞被保留下来用于后续分析。通过经典marker基因的鉴定，作者捕获到的非PC恶性细胞主要分为:B细胞，CD4 T细胞，CD8 T细胞，髓系细胞和成纤维细胞(图1a)。同时作者发现，不同患者的免疫细胞按细胞类型混合在一起，而PC恶性细胞则按患者不同自成一簇（扩展图1），说明不同患者的PC细胞可能存在较大差异。
上：图1a 下：扩展图1
因此作者聚焦于PC细胞(n = 31,131)，对其进行再分群，得到了14个新的细胞群，并使用差异表达基因作为各细胞群的marker(图1b)。14个细胞群中，有7个完全由单个患者PC细胞组成，另7个细胞群的细胞也主要来自于单个患者，表明PC细胞在患者间具有高度异质性。
图1b
结果2：肿瘤细胞谱系推断结果
为绘制PC细胞图谱，确定每个细胞的转录组状态和PC的潜在细胞起源，作者使用HCL数据库映射分析对细胞类型进行比对。结果表明，虽然所有病例都为胃腺癌的腹膜转移瘤，但其肿瘤细胞谱系却各不相同(图1 c)。只有约70%的PC细胞被定义为胃来源细胞,包括隐窝细胞(47%),粘膜细胞(22%)和主细胞(0.5%)。而26%的PC细胞转录谱与其他胃肠道细胞相似，主要是肠道细胞(21%)。基因差异分析结果显示，主要的细胞类型如结直肠样细胞、十二指肠样细胞、胃细胞等呈现各自的谱系特异性基因表达(图1d,e)。
对于混合胃和结肠上皮细胞的IP-158和IP-010这两例肿瘤样本，作者检索了其对应的原发胃腺癌肿瘤的组织学图像，证实肿瘤发生在胃肠道化生的背景下，特征为：胃粘膜中存在形态良好的杯状细胞(图1 f)。至于病例IP-070，前面的分析表明其PC样本没有胃肠道来源细胞，其转录谱与乳腺管腔上皮细胞表达谱相似(图1c)，作者在复查该患者的临床记录后，发现该病例为乳腺癌胃转移形成的PC。这些结果反映了细胞系分析的准确性。
图1d-f
结果3：肿瘤细胞谱系多样性与瘤内异质性显著相关
3.1转录组的瘤内异质性
为了进一步研究转录组的瘤内异质性并探究其与肿瘤细胞谱系组成的关系，作者使用Seurat和Monocle这两款软件对PC细胞的各cluster再次进行了无监督聚类分析(图1g,h)。与预期一致，能看到胃细胞与结直肠样细胞各自聚集区分开来，在UMAP可视化结果中更为明显，在病例IP-009中，胃隐窝细胞也与胃粘膜细胞明显区分开来(图1h)。说明肿瘤细胞谱系成分的多样性可能是导致转录组瘤内异质性的原因之一。
图1g-h
此外，作者使用巴氏距离来衡量细胞谱系之间的基因表达分布的相似性。结直肠样细胞与胃隐窝(或粘膜细胞)的距离明显大于同谱系细胞间的距离(扩展图6)，表明结直肠样细胞的转录谱不同于胃来源细胞。作者还尝试证明无监督因素可以解释肿瘤间异质性，于是对所有患者的肿瘤细胞进行了SC3无监督聚类，但并未发现临床、组织病理或分子指标与SC3定义的细胞群之间存在显著关联。通路富集分析发现有部分病例的细胞倾向于聚集在一起，并显示出代谢和致癌途径活性的升高，表明肿瘤固有信号通路可能导致了患者间的转录组异质性。
扩展图6
3.2基因组的瘤内异质性
接下来他们研究了PC细胞的基因型异质性，及其与肿瘤细胞谱系的相关性。首先从scRNA-seq数据中推断出大规模拷贝数变异(CNVs)结果，然后进行系统性重组分析。结合6例患者的基因组全外显子(WES)测序结果，证实大规模CNVs与WES数据得出的CNVs具有良好的相关性（补充图15）。作者分别在细胞谱系和患者这两个水平上对推断的CNVs进行了无监督聚类，观察到相比瘤内，肿瘤间异质性更大（补充图16-17）。
补充图15
补充图16-17（part）
CNV分析结果显示，部分PC样本表现出高水平的瘤内异质性，比如病例IP-067(图2a)：系统性重组分析鉴定出5个具有不同的CNV谱的亚群(B1-5)，且这些亚群与前面推断的肿瘤细胞谱系较好地吻合，其中最大的亚群B5，呈现结直肠样转录谱，对应Monocle细胞簇C1；亚群B2则完全由胃来源细胞组成，对应Monocle细胞簇C3；来自B1、B3和B4的细胞显示出与B2或B5共有的CNV谱，主要富集在连接C1和C3的Monocle细胞簇C2中(图2a)。作者进一步对scRNA-seq数据的3 '非翻译区(UTR)进行了体细胞突变分析，揭示了基因组层面的瘤内异质性：C1亚群36%的体细胞突变在C2和C3中没有检测到，且总共只有26%的突变为三个亚群所共有(图2a右下角)。然而，病例IP- 009的情况又有所不同(图2b)：尽管主要由胃隐窝细胞组成的monocle细胞簇C1和主要由胃粘膜细胞组成的C2明显分离，系统性重组分析得到的三个亚群的CNV谱差异并不明显。体细胞变异分析显示，约60%的突变由两个细胞群共有(图2b，右下)，说明他们具有相对相似的基因组背景。
图2a-b
3.3细胞增殖特性与瘤内异质性
接下来作者探究了肿瘤细胞增殖特性的瘤内异质性，及其与肿瘤细胞谱系的关系。基于细胞周期相关特征基因的表达谱，他们计算了每个细胞的细胞周期状态，并比较了各细胞谱系细胞的增殖特性(图2c - e)。结果显示，在所有细胞中，胃隐窝细胞的增殖性最强，具有高G2M和S评分(图2c)，以及高比例的周期细胞(图2d)。约72%的胃隐窝细胞处于细胞周期，其比例远高于胃粘膜细胞(27%)或肠样细胞：结肠杯状细胞(58%)、结肠肠细胞(34%)、直肠(15%)和十二指肠细胞(18%)。这些结果与之前的观察一致:胃隐窝细胞的更替速度比胃粘液分泌细胞快，同时大量报告显示，肠表面上皮如杯状细胞也拥有较高的更新速度。一致地，一些关键的细胞周期调控基因在肿瘤细胞谱系间存在差异表达(图2e)。
图2c-e
结果4：染色体17q区拷贝数增加患者预后更差
作者分析了所有病例的CNVs，发现17q拷贝数增加在胃来源细胞中普遍存在，且只存在于短期存活者的肿瘤细胞(图3a)。通过整合基因型和转录谱，他们确定了一个位于染色体17q上的基因列表：17q拷贝数明显增加的肿瘤细胞相较于其它细胞表达上调的基因，与病人生存情况相关联(图3 b, c)。其中包含一些关键信号通路相关基因(如PI3K/AKT/ mTOR，mTORC1, MYC)和潜在治疗靶点基因(例如，HN1, GRB2, PSMB3)。然而，由于CNV谱是由scRNA-seq数据推断出来的，其分辨率低，分析受到限制。因此作者在两个独立的胃腺癌队列中进行了验证分析：TCGA中的原发性胃腺癌队列(n = 411;图3d)和转移性胃腺癌队列(n = 45;图3 e)。两个队列的数据均表明，肿瘤染色体17q区拷贝数增加的患者生存期明显更差。
图3a-e
结果5：细胞信号异质性与肿瘤细胞谱系/状态有关
为探究上述转录组和基因型改变导致的分子效应，并更好地理解与患者生存相关的生物过程，作者对900多个基因进行了通路富集分析。得到80条在肿瘤细胞谱系间差异表达的通路(图4a)，其中37条通路与患者生存密切相关(图4b)。根据生物学功能将这些通路分为五大类:致癌信号通路、细胞周期、DNA修复、代谢和免疫信号。通路互作分析结果显示，这些生物功能是相互连接的(图4c)。
胃来源细胞富集到的与生存期短相关的信号通路包括细胞周期、DNA修复、PI3K/AKT/mTOR、mTORC1、Wnt、NF-κB和代谢重编程，主要为致癌性通路。结直肠样肿瘤细胞中富集到的且与更长的生存期相关的通路包括防御素、IL-7信号转导、补体级联、IL6/JAK/STAT3信号转导和干扰素α / γ，为免疫相关通路(图4a,b)。这些结果表明，不同谱系或转录组状态的肿瘤细胞可能涉及不同的生物学过程，从而导致了不同的分子效应和生存时间。
图4a-b
为评估胃细胞主导和胃肠混合肿瘤的免疫微环境的细胞组成是否不同，作者使用公共数据集的bulk表达数据进行了免疫浸润分析（图4d）。结果显示，相比胃细胞主导肿瘤，具有胃肠混合特征的肿瘤中，B细胞丰度得分显著增加，且m1样巨噬细胞(促炎)比例较高，m2样巨噬细胞(抗炎)比例较低。此外，癌症相关成纤维细胞的丰度得分也有显著差异，在胃肠混合肿瘤中得分较低。总之，具有胃肠混合特征的肿瘤免疫更为活跃。
图4c-d
结果6：单细胞分析将PC病例分为预后截然不同的两种亚型
根据肿瘤细胞谱系组成，作者将PC样本分为两个主要亚型:胃主导型和胃肠混合型(图1c)，相关性分析结果显示，两种亚型的组织病理学特征无明显差异，但值得注意的是，基于细胞谱系划分的PC亚型与患者生存表现出很强的相关性(图1 c)：所有胃肠混合型病例（6例）都为长期生存者，而3/4的胃主导型病例（6/8例）为短期生存者(图5a)。另外，胃主导组的17q拷贝数增加现象显著富集(补充图23)；目前还缺乏一种有效且实用的PC分子标记对患者进行分类，而上述结果表明，PC肿瘤细胞的转录组特征可以预测患者的生存。
图5a
补充图23
结果7：12个基因组成的预后标记的发现与验证
因此，作者想要找到能分类患者的基因表达标记。他们对胃主导型和胃肠混合型PC肿瘤细胞进行了基因表达差异分析，识别出最显著的差异基因后，根据与患者生存的统计相关性进行进一步筛选，并采用向前选择法检测基因组合(图5b)。经过多步筛选得到了由12个基因组成的标记(图5c)。
图5b-c
然后他们在一个独立的胃腺癌PC队列中验证了这个标记（n = 45）。首先对每个肿瘤样本的bulk RNA测序（RNA-seq）数据进行标记评分，并根据评分将样本分为胃主导型或胃肠混合型以进行后续分析(补充图24)。结果显示该标记能很好地预测患者预后，与胃肠混合组相比，胃主导组的患者生存时间明显缩短(7.8个月 VS 24.5个月)(图5d左)。多因素回归分析结果显示，该标记是短生存期的一个强预后指标（图5d右），且独立于临床/组织病理学变量。
图5d
作者还在其他4个大规模原发性胃腺癌队列（总计1,336例患者）中评估了其预后意义。值得注意的是，尽管该标记来自于转移性胃腺癌队列，但它在这4个原发性队列中仍具有预后意义(图5e-h)。多因素回归分析结果显示，在考虑了之前定义的分子亚型(包括MSI和EMT分型；代谢、增殖和侵袭特征分型；年龄、性别和组织学类型等分型）的情况下，其预后价值仍然得以保留(扩展图9)。此外，在TCGA和Cristescu队列中，该标记与局部复发及远处转移的风险有很强的相关性(图5e)。这些结果进一步证实了这个标记的预后价值，及其在预测患者生存中的稳定性。
图5e-h
扩展图9
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