Neuron：单细胞测序揭示脑小胶质细胞和髓细胞的发育异质性 |单细胞专题
期刊名称：Neuron
影响因子：18.688
发表时间：2018年12月
发表单位：斯坦福大学
所用组学：Smart-seq
小胶质细胞又被称为脑实质巨噬细胞，与许多神经系统疾病息息相关，如阿尔茨海默病、脑肿瘤等。除了其经典的免疫监视和清除功能，最近的研究发现小胶质细胞通过调节神经发生和修剪突触参与神经发育。但是目前尚不清楚这些功能是由小胶质细胞的亚群在发育和成年的不同阶段完成的，还是在特定的大脑区域内完成的。在本文中，作者对胚胎、出生后早期和成年小鼠大脑不同区域的小胶质细胞和相关髓系细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），从而探究小胶质细胞对神经发育和神经退行性疾病的作用是在发育和成年的不同阶段完成的，还是在特定的大脑区域内完成的。
图1A为实验流程图，作者对小鼠胚胎第14.5天（E14.5）、出生后第7天（P7）以及成年小鼠（P60）的小胶质细胞和髓细胞进行研究。首先利用Kit−CD45+、CD45lowCD11b+与CD45hiCD11b+分别对E14.5、P7、P60时期的小鼠脑细胞进行分选（图1B）。其中有1816个细胞通过了下游分析的质量控制，包括142个E14.5时期的细胞、978个P7时期的细胞和696个P60的细胞，对所有1816个细胞进行了无监督聚类分析，产生了15个不同的簇。观察发现小胶质细胞、脉络丛细胞或单核细胞等不同簇在tSNE图上的位置接近，这暗示了每种细胞类型簇之间具有相似性（图1C）。
通过差异基因表达分析，将每个簇的富集基因列表作为潜在标记物，这些基因的独特表达或组合表达代表了个体簇的身份（图1F和图1G）。其中相邻的簇0-6表达小胶质细胞特征基因，因此被认为是小胶质细胞样细胞（图1C）。这些细胞主要从CD45low门中分离出来，而其他非小胶质细胞簇的细胞则几乎都来自CD45hi门（图1D）。小胶质细胞样簇中存在许多来自P7阶段的CD45 hi细胞，表明P7时期的小胶质细胞具有CD45免疫表型的异质性。
作者首先研究了非小胶质细胞簇，发现脉络丛巨噬细胞被分成两个不同的簇，簇7和簇9（图1E）。在簇7中检测到高水平的MHC-II基因表达以及免疫调节基因的表达升高，在簇9中检测到在营养物质和信号分子运输中起作用的基因（图2A）。其中Clec4n为刚出生小鼠的脉络丛巨噬细胞的分子标记物、H2-Eb1和Lilra5为成年小鼠的脉络丛巨噬细胞的分子标记物，并通过免疫荧光验证了这种选择性基因的表达（图2B–2D）。由此可知，脉络丛巨噬细胞在出生后转录发生改变。
为了探究成年期小鼠的稳态小胶质细胞的转录组的异质性，作者通过tSNE图发现在7个小胶质细胞簇中，只有簇0和簇6中存在成年期小鼠的小胶质细胞（图1C-1E）。两个簇都表达了相似水平的稳态小胶质细胞特征基因，但簇6中的P2ry12表达略有降低，与簇0相比，簇6中只有27个基因有差异，其中一半是立即早期基因（图3A）。
为了确定立即早期基因是否是人为原因产生，研究人员检查了两个上调的IEG基因Fos和Egr1在组织切片上的表达，发现成年小胶质细胞中的Fos/Egr1染色呈阴性，而在非小胶质细胞中则检测到了它们的表达（图3B、3C），所以检测到的IEG基因是由于实验过程中的人为操作引起。只有不到20个基因在不同大脑区域之间有差异表达（图3F）。
为了探究这15个差异基因是否是由于scRNA-seq的敏感性问题，研究人员对用TMEM119抗体分选的大脑不同区域的高纯度稳态小胶质细胞进行了RNA-seq。结果发现来自皮层、小脑、海马和纹状体的样本高度相关，并且发现样本并没有根据不同大脑区域的来源进行聚类（图3D、3E）。不同大脑区域的成年小胶质细胞几乎不存在转录组的异质性。
在scRNA-seq分析中，细胞周期基因可以引起细胞间的异质性，从而掩盖细胞之间的其他有意义的差异。为了消除这种影响，研究人员使用已建立的算法来消除细胞周期效应，然后对P7的小胶质细胞进行重新聚类，得到P7-C0、P7-C1和P7-C2三个簇。这三个簇对应于原始分析中发现的簇1、2和5，并且簇3和4只是在P7-C0中重新分布（图4A）。无论细胞周期状态如何，在P7阶段只有3类小胶质细胞。
为了了解小胶质细胞分裂的基因调控，研究人员利用了scRNA-seq数据，并通过计算重建了这个分裂过程，得到了不同细胞周期基因的表达水平（图4B）。小胶质细胞特征基因则以一致的水平表达（图4C）。
通过算法鉴定了P7-C0的254个基因和P7-C1的227个基因，并且两个簇中有183个基因重叠。将这些基因列表与四个已发表的细胞周期基因的数据集进行比较，发现大多数发现的基因相同，也有一些新基因（图4D）。根据基因功能注释，这些新基因中有一半以上可能与细胞增殖有关（图4E）。例如，我们发现了参与DNA损伤反应和修复的基因（Ankle1、Lig1、Rpa1）、组蛋白mRNA衰变的基因（Eri1），以及具有表观遗传功能的基因，例如不依赖复制的组蛋白（H2afz、H3f3b）和染色质修饰剂（Hmgn2,Dnmt1) (图4F).
了解出生早期的小胶质细胞的异质性，研究人员检查了三个细胞周期回归后的P7簇，其中P7-C2是一个小簇，主要包括与胚胎时期的（E14.5）小胶质细胞（簇5）聚集在一起的细胞，表明在小鼠出生后的大脑中存在原始小胶质细胞（图5A）。属于P7-C2的细胞在较低水平表达小胶质细胞特征基因，并且上调基因分布在金属稳态、肌动蛋白细胞骨架动力学和核糖体成分中（图5B）。
而大多数P7时期的小胶质细胞都落在P7-C0或P7-C1簇，并且都表达了稳态基因，例如Tmem119、P2ry12等，但P7-C1细胞的稳态基因表达量较低（图5C）。然而P7-C1小胶质细胞特异性表达的许多基因在退行性疾病相关小胶质细胞（DAM）中上调。为了更好地了解P7小胶质细胞异质性背后的基因，作者基于所有P7小胶质细胞中基因之间的相关性生成了一个基因网络（实线表示正相关，虚线表示负相关），发现疾病基因的上调伴随着稳态基因的下调（图5D、5E）。
通过进一步研究，作者发现这个小胶质细胞亚群（PAM）有着标记基因Spp1和Gpnmb，这可以将其与所有其他髓细胞群区分开来（图6A）。通过RNA原位杂交发现这两个基因的表达几乎只在胼胝体和小脑白质中重叠，并且Spp1和Gpnmb阳性细胞同样对小胶质细胞标记Cx3cr1表现出阳性（图6B、6D)。scRNA-seq数据表明，P7-C1簇的细胞表达高水平的Igf1和Itgax。通过免疫荧光也能检测到Gpnmb阳性细胞中存在这两种转录物的共表达（图6C）。由于这些小胶质细胞主要出现在出生后早期大脑发育中的白质中，同时也存在于其他有细胞增殖的神经源性区域，所以将P7-C1群体命名为增殖区相关小胶质细胞（PAM）。
作者发现出生后早期PAM和脑室周围细胞特异性表达CLEC7A蛋白，这是DAM 的标记物（图 6A、6E）。为了进一步确定了这个小胶质细胞群的身份，则使用表面蛋白 CLEC7A和GPNMB对P7小胶质细胞进行染色，并通过FACS对双阳性细胞进行分类（图6F）。GPNMB+CLEC7A+细胞也表达更高水平的LILRB4和CD63，它们是P7-C1簇细胞的RNA特征的一部分（图 6A、6F、6G）。基于GPNMB和CLEC7A共表达而新分离的小胶质细胞的scRNA-seq验证了这个小胶质细胞群的身份，通过聚类算法还发现一个GPNMB+CLEC7A+的细胞簇，该簇与部分P7-C1细胞重叠（图6H、6I）。这个新的双阳性簇表达了在P7-C1中发现的所有标记，只是平均水平更高，而且在细胞中的比例更高，这可能是由于出生后早期的PAM亚群在其最极化状态下的富集（图6I）。
因为从P7-C0到P7-C1再到P7-GPNMB+CLEC7A+细胞的整体基因表达似乎存在梯度变化（图6H），通过将P7时期的scRNA-seq数据与P60稳态小胶质细胞数据相结合，并进行发育伪时间分析。发现一条轨迹指向出生后早期PAM，而另一条轨迹指向稳态小胶质细胞（图6J）。这些数据表明，出生后未成熟的小胶质细胞可以表现出稳态小胶质细胞的特异性基因，也可以表现出PAM表型（图6K）。
为了研究PAM在发育过程中的时间和空间表现，研究人员用CLEC7A抗体对从E17.5到P60的脑切片进行染色。发现CLEC7A+小胶质细胞在发育中的白质中短暂出现，并在神经发生区域发现。在胚胎晚期（E17.5）阶段，CLEC7A+小胶质细胞几乎只出现在侧脑室附近的神经源性壁龛中，而CLEC7A-IBA1+细胞存在于整个脑实质。从P4开始，CLEC7A+小胶质细胞填充了胼胝体和小脑白质（图7A），并且在P7时期达到顶峰（图6E、7B）。到P14，这些白质内几乎无法检测到PAM（图 7A、7B)。从P14开始，CLEC7A+小胶质细胞开始出现在海马齿状回区域、脑室下区以及沿喙侧迁移流（图7A、7C、7D）。在形态学上，P7时期的白质中的CLEC7A+小胶质细胞呈变形虫状，初级分支较粗，细胞体较大（图 7E-7G）。这些数据表明，发育中的白质中的PAM是在P7时期出现的特殊群体，而不是小胶质细胞不成熟时的状态。
由于退行性疾病相关小胶质细胞（DAM）的转录变化依赖于TREM2-APOE通路，作者又对Trem2或Apoe敲除小鼠的P7白质进行免疫荧光实验，发现Gpnmb+ Spp1+CLEC7A+小胶质细胞仍然密集分布在敲除小鼠的P7白质中（图7H）。这些数据表明，出生后早期的PAM与DAM不同，不依赖于TREM2-APOE通路。
为了研究出生后早期PAM的生物学功能，作者进行了组织学观察，发现发育中的白质中的CLEC7A+小胶质细胞具有变形虫形状并且经常含有固缩核（图8A、8B）。通过在大脑区域量化吞噬荧光珠的小胶质细胞百分比，比较出生后早期的小鼠大脑中CLEC7A+和CLEC7A-小胶质细胞的吞噬能力，发现只有胼胝体和小脑白质中的CLEC7A+小胶质细胞会迅速吞噬珠子（图8C、8D）。结果表明，出生后早期PAM具有高度吞噬性。
作者推测出生后早期PAM可能会吞噬将死的少突胶质细胞。于是在CX3CR1-GFP小鼠中，用MBP标记少突胶质细胞，发现小胶质细胞与发育中的白质中的星形少突胶质细胞相互作用（图8E），并且出生后早期PAM含有cCASP3阳性包裹体，这些包裹体呈MBP阳性并具有核固缩（图8E、8F）。这些数据表明，出生后早期的PAM在髓鞘化过程中会吞噬垂死的新形成的少突胶质细胞。出生后早期PAM 经常包裹cCASP3阴性少突胶质细胞，此举可能提高了它们积极促进细胞消除的作用（图8G）。
通过观察发现PDGFRA+少突胶质前体细胞（OPCs）很少与出生后早期PAM并列出现（图8H），表明这种吞噬活动主要针对新形成的少突胶质细胞，而不是它们的前体。而星形胶质细胞虽然与出生后早期PAM之间存在大量相互作用， 但没有观察到cCASP3+Aldh1l1-GFP标记的星形胶质细胞（图8H）。根据scRNA-seq数据，P7-C1和P7-GPNMB+CLEC7A+小胶质细胞的Mbp、Gfap基因的检出率比P7-C0小胶质细胞高2倍以上（图8I）。这些数据表明，出生后早期 PAM吞噬新形成的少突胶质细胞，并且可能在较小程度上吞噬星形胶质细胞。
本研究对胚胎、出生后早期和成年小鼠大脑的各个区域分选出来的小胶质细胞和相关骨髓细胞进行了单细胞转录组测序，构建了小鼠不同生长阶段不同大脑区域细胞的细胞类型特异性基因表达图谱。研究数据表明，小鼠脑中脉络丛巨噬细胞有两种细胞类型，一种表达高水平的MHC-II基因以及免疫调节的基因，另一种则表达营养物质和信号分子运输中起作用的基因，并且脉络丛巨噬细胞会在发育过程中开启稳态基因。成年期小鼠不同大脑区域的成年小胶质细胞几乎不存在转录组的异质性。在排除细胞周期基因可能引起细胞间的异质性后，发现无论细胞周期状态如何，在P7阶段只有3类小胶质细胞（P7-C0、P7-C1和P7-C2），通过与其他数据集的对比发现了一些新基因，有一半以上可能与细胞增殖有关。通过对单细胞转录组测序数据的分析，发现出生后早期的小胶质细胞存在异质性，P7-C1小胶质细胞特异性表达的许多基因在退行性疾病相关小胶质细胞（DAM）中上调。单细胞转录组同时揭示了出生后未成熟的小胶质细胞可以表达稳态小胶质细胞的特异性基因，也可以表达与DAM相似的PAM表型。PAM是在P7时期出现的特殊群体，而不是小胶质细胞不成熟时的状态。并且PAM不依赖于TREM2-APOE通路发生极化。单细胞转录组PAM的作用是吞噬新形成的少突胶质细胞，并且可能在较小程度上吞噬星形胶质细胞。这为剖析先天免疫细胞对正常发育和脑部疾病的贡献打下了重要基础。
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