如何采集植物微生态样本，看这篇就够了！
植物和微生物都是自然界中非常重要的组成部分，植物生长过程离不开微生物的作用，与植物根相关的微生物群落，包括根际微生物群落和根内生微生物群落，被认为是植物基因组的重要延伸。根际微生物群落是指距离根部几毫米范围内的特定微生物群落，这个复杂的生物系统由巨大的相互连接的微生物网络组成，这些微生物直接与植物宿主相互作用，包括古生菌、细菌、真菌、微真核生物和病毒。
根据与植物相关微生物的生存位置可以将微生物划分为植物内生菌和植物表面菌。植物内生菌可以根据植物组织部位在进行精细划分，比如根、茎、叶、花、果实、种子等部位对应的微生物群落，表面菌也可以具体划分为贴近/附着植物表面的微生物群落，比如根、茎、叶等表面微生物，以及远离植物表面的微生物群落，比如根周围稍远的土壤微生物群落。这些不同的微生物群落跟植物相互作用，共同组成了植物微生态环境（图1）。
图1 植物根际微生态 White, R.A., III et al 2017.
为了研究植物本身微生物的状况或植物与环境微生物的关系时，需要对植物体及植物体周围环境中的微生物进行检测。目前常用的方法是利用二代高通量测序技术来检测目的样本中的细菌、真菌等微生物，那么待检样本的精准采集就显得尤为重要。
1）研究根际微生物多样性
大多植物生存是离不开土壤的，研究植物根际土壤间微生物的多样性，有助于更好理解植物生长问题。
2）研究根表、叶表等组织表面微生物多样性
有些研究注重植物表面微生物的群落结构和作用，来揭示植物与周围环境的互动过程。
3）研究根、茎、叶等植物组织内生菌的多样性
植物组织内也会存在许多微生物，植物与许多内生菌是互惠共生的，一方面植物为内生菌提供营养物质，另一方面内生菌则能影响刺激植物的生长发育，植物组织内生菌的研究一直都是植物界方面研究的重点。
想正确的开展研究，不仅实验材料要悉心培育，最终的样本采集也是重中之重。前期有说过我们样本采集的5大原则（代表性、准确性、迅速性、分装备份及低温原则），那么本期我们就围绕着五大原则来阐述植物微生物相关样本如何准备。
无论怎样，第一步还是要有完善的实验方案，然后再进行植物样本培育，否则样本吭哧吭哧长了一年才发现实验设计的不对，那就只能流下悔恨交织的热泪了。这里不是我们要说的重点，就不赘述了，下面让我们直接来到成熟样本的采集环节（以大田培育植物样本为例）。
操作步骤如下：
按照采集顺序可分步获取根部外围土壤/对照土壤、 根际土壤、 根表面微生物、 以及用于内生菌研究的组织。
采样材料：2/15/50mL离心管、无菌PBS（或生理盐水）、铁铲、高速离心机、超声仪
图2 植物根际微生态样本采集 Edwards et al 2014.
1) 根部外围土壤/对照土壤：使用无菌处理过的铲子将整株植物连带根部尽量完整的挖取出来，采用抖土法抖掉与根系松散结合的土壤，留下大约1mm仍然附着在根部的土壤，抖落下来的土壤可以收集起来作为Bulk soil（根部外围土壤/对照土壤）。
2) 根际土壤：附着在根部的土壤可以使用无菌毛刷富集起来（土质比较疏松的沙土类），也可以将附着土壤的根放入装有无菌PBS的50mL离心管中手动摇晃，将附着在根部的土壤清洗到液体中（黏度较大的黏土），此时收集到的土壤/溶液沉淀作为Rhizosphere soil（根际土壤）。
3) 根表面微生物：将手动摇晃清洗过的根转移到新的装有无菌PBS的15/50mL离心管中，然后使用50-60Hz超声波清洗30s，使用无菌镊子将根取出，剩余溶液可分装入多个2mL离心管,便于高速离心，12000g，5min富集菌体，此时收集的沉淀可作为Rhizoplane（根表面微生物）（图2）。
4) 植物内生菌：再次将清洗过的根转移到新的装有无菌PBS的15/50mL离心管中，然后使用50-60Hz超声波清洗30s，重复该清洗步骤两次，取出干净的组织放入预先准备好的无菌收集管中，此时的组织样本可用于后续内生菌的研究（Endosphere）。
1）表面菌富集
根据需求取一定量的植物组织样本转移到新的装有无菌PBS/生理盐水的15/50mL离心管中，放入摇床300rpm震荡2h，将完成富集的15/50mL离心管放入离心机200g离心2min（去除碎片），吸取上清转移到新的无菌离心管中，可分装入多个2mL离心管,便于高速离心，12000g，5min富集菌体。
2）植物表面无菌处理
将采集的新鲜植物组织上的杂物用自来水清洗干净，切成小段，吸干水分，用5%次氯酸钠或升汞浸泡消毒1min，75%酒精浸泡消毒１min，酒精清洗重复2次， 再用无菌水清洗 2~3 次至彻底清洗干净，用灭菌滤纸将组织水分吸干，清洗干净的组织放入预先准备好的无菌收集管中，此时的组织样本可用于后续内生菌的研究（Xiaoxu Sun et al 2014.）。
以上每一步获得的样本都需要立即进行分装、低温预处理及冻存，等到需要进行实验时再取出检测。
根际微环境是联系应用微生物学、植物生物学和生态学的桥梁，多组学研究将有助于更好地了解根际微生物及其在植物生长、作物生产和生态系统健康中的作用。植物微生物的相关研究日益增多，希望本篇植物微生态样本采集方案能给各位老师带来一点帮助。当然，植物样本多种多样，一种方案不能解决所有问题，如果大家有更好的样本处理方案，欢迎随时来信交流。
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