【收藏】一文讲透环境微生物组研究怎么做 | 微生物专题

摘要：用研究案例说事

内容导览

1. 土壤微生物组研究概览

2. 水体微生物组研究概览

3. 环境微生物组研究思路和方法

3.1 土壤微生物组研究

3.1.1 单组学单对象研究思路

3.1.2 单组学多对象研究思路

3.1.3 多组学研究思路

3.2 水体和沉积物微生物组研究

3.3 研究思路和方法小结

微生物广泛分布于我们生活的环境甚至是极端环境中，通常不是单个存在，而是与周围环境中的其他微生物形成群落，通过复杂的相互作用表现出生态系统功能。环境微生物组研究的特定环境包括自然环境（如湿地、河流、湖泊、海洋、土壤、植物、大气、极端环境）和人工环境（如养殖池塘、生物反应器）等。环境类型非常多，本节我们重点介绍土壤和水体微生物组。

我们先来看一组数据。使用PubMed对土壤和水体微生物组的相关研究进行检索（关键词：microbiome搭配soil、rhizosphere、mud、water、river、lake、或sea），并对2010年以来这12年间的发文数量进行统计（图1）。无论是土壤环境还是水体环境，微生物组相关研究每年都在快速增长，说明环境微生物组研究一直是被研究者重点关注的领域。环境微生物组相关研究可以揭示特定环境中微生物多样性、功能、互作、动态和演化，包括了环境微生物组-环境互作、环境微生物组-宿主互作、环境微生物组演替与进化等。

图1 土壤和水体微生物组相关研究发文数量

1.土壤微生物组研究概览

对土壤微生物组来说，研究的核心内容是特定土壤中微生物群落的协同演化规律及其环境功能。土壤微生物主要承担以下几种功能：

土壤中有机质的分解与积累。对于有机污染物而言，通过微生物的代谢和共代谢过程，污染物得以转化或彻底分解矿化。例如，通过稳定性同位素探针技术已探明土壤中能够降解多环芳烃的微生物群落，特别是发现一些尚未得到人工分离和培养的新型微生物类群[1]，并在堆肥系统发现了降解多环芳烃的重要功能的微生物组[2]。这些研究有利于探索新的代谢途径，并可通过微生物改造优化为生物修复提供理论和技术支持。

微生物代谢也会影响金属和类金属污染物毒性和生物有效性。比如，土壤中砷的氧化-还原和甲基化等过程主要由微生物驱动[3]。通过添加有机质可以改变土壤微生物群落、调控相关功能基因表达及其物理化学条件，从而提高水稻土中砷的生物甲基化，缓解砷的毒性或提高生物修复效率[4]。

土壤微生物是陆地生态系统植物多样性和生产力的重要驱动者，直接参与了植物获得养分和土壤养分循环两个过程。共生固氮菌、菌根真菌和根际促生菌能够直接增强植物获得养分的能力。同时，土壤微生物能够影响土壤养分循环过程，提高土壤养分的生物有效性，间接改变植物养分的获得量。

对于农业生产来说，农作物根际土壤微生物既有利又有弊，一方面根际土壤微生物可以帮助农作物抵抗疾病、促进生长、增强作物抗逆性和提高作物的产量及品质等。比如改变根际土壤微生物多样性和群落结构，可以降低柑橘黄龙病的发病率，提高了柑橘的品质[5]。但另一方面，根际土壤里病原菌也会在一定程度上抑制作物的正常生长。通过对根际土壤微生物的研究，可以挖掘对植物生长有利和有害的菌群，探究其原理，趋利避害，并在生产上加以运用。有研究发现，植物苗期的微生物群落通过产生病原菌抑制物，形成抑制型细菌群落，从而有效抑制病原菌的入侵[6]。这一发现，为农业系统植物病害管理提供了新的思路，通过管理土壤微生物群的整体组成，可以更好地控制植物病害的爆发。

2. 水体微生物组研究概览

水体环境，主要有江河湖海、人工池塘、地下水系等。与土壤微生物的功能类似，水体环境中的微生物主要功能是参与物质循环。而这些物质，不仅仅是有机物，还有水体中的污染物，比如重金属等。随着我国经济的迅速发展，大量开采重金属矿藏、不合理堆放工业废物、产生大量生活垃圾等人类活动的加剧，使得各种污染物进入了江河湖海。

通过对江水和河水微生物的研究，可以帮助改善排入江河的污水处理问题。对于水中的重金属而言，重金属污染是危害最大的水污染之一，其中污水中重金属镉（Cd）、铬（Cr）的污染尤为突出。重金属污染由于其高毒性，不可生物降解性和生物富集性，严重威胁着人类健康和生态系统的稳定。化学方法去除水体中的重金属，往往面临的是高昂的成本。但随着近年来微生物技术的发展，人们利用微生物中的细菌、真菌、藻类细胞壁结构具有像离子交换树脂一样的离子交换特性，可以高效、快速地从复杂溶液中螯合吸附重金属离子。Benmalek等利用微球菌2YB-25OH菌株在pH 6.5的条件下进行Cd的吸附，并且吸附率可达38%[7]。

地下水也是我们日常饮水来源，地下水中的微生物与我们的健康息息相关。地下水中微生物介导多种元素的地球化学循环，包括氮、碳、铁、硫和砷等。这些元素循环之间也相互影响。地下水污染是全球普遍关注的环境问题之一，地下水环境特殊性和污染物复杂性加大了地下水污染修复难度。对于地下水修复方法，近年来研究较为火热的方法为微生物修复。微生物修复以微生物自身代谢功能为基础，相对其他技术具有成本低、对环境扰动小等优点，在地下水污染长期修复中优势明显。目前，地下水的微生物修复研究主要包括自然衰减修复和生物刺激修复。自然衰减修复是指地下水中天然存在的微生物通过代谢作用在合理时间段内实现污染物浓度和总量的减少，当自然衰减不足以应对污染场地修复要求时，就需人为添加修复剂或功能菌群进行环境调控，即生物刺激修复。生物刺激修复通常从两方面入手，一方面向污染地下水中添加修复剂，通过环境调控来提高土著微生物降解污染物的能力；另一方面向污染地下水中添加经实验室驯化的功能菌群来降解污染物。PARK等以延胡索酸盐作为碳源来刺激土著微生物提高反硝化速率，加速降解地下水中NO₃^-[8]。Michalsen等采用原位修复法成功使用两株菌I-C和KTR9将地下水中的环三次甲基三硝基胺快速降解[9]。

海洋微生物不仅在表层水中比较常见，而且在深海海底也有广泛的分布，被认为是海洋碳、氮、硫循环的引擎。海洋中的微生物多数是分解者，但有一部分是生产者，因而具有双重的重要性。实际上，微生物参与海洋物质分解和转化的全过程。通过对海洋微生物的研究，可以帮助我们充分利用海洋资源，使之能够为人类提供种类繁多、分手结构新颖、化学组成复杂和生理活性特异的海洋天然产品。此外，研究表明，气候变化影响海洋微生物群落结构，通过对微生物群落结构的变化研究，来研究气候变化趋势。

3. 环境微生物组研究思路和方法

围绕环境微生物群本身，目前开展较多的实验有扩增子测序，宏基因组测序，以及宏代谢组；讨论微生物群与环境/宿主互作，可以结合上宿主转录组，蛋白质组，代谢组等多组学一起分析。此外，通常会结合环境理化指标和宿主生理生化指标一起做相关性分析。

下面通过一些代表性的土壤包括根际土壤、水体以及沉积物的微生物组研究，对其中的研究目的、研究样本、样本重复数、研究方法、研究设计（从单组学到多组学）、以及研究发现进行详细解析，以帮助大家更快地掌握环境微生物组研究的核心思路和方法。//

3.1 土壤微生物组研究

3.1.1 单组学单对象研究思路

案例1：根际微生物的变化影响宿主对干旱的适应性

发表期刊：Frontiers in Microbiology

影响因子：5.640

发表时间：2021.10

研究目的：探讨甘蔗根际微生物对干旱胁迫的影响

研究样本：根际土壤

研究方法：16S测序

样本数量：3个品种×2种处理×10个重复，共60个

研究设计：

作者选择的3个甘蔗品种为：桂糖21（GT21）、桂糖31（GT31）、桂糖42（GT42）。种植时每个品种20盆，共60盆。在苗期（80%的甘蔗芽有23片真叶），每个品种随机选择10个花盆进行干旱处理（做为实验组D），其余10个作为对照组（C）。在培养条件上，处理组与对照组应保持单一变量的原则，以保证实验的真实性和可靠性（图1）。

图1 研究设计

研究结论：

甘蔗根际微生物群落结构相对稳定，但干旱胁迫仍导致甘蔗根系微生物物种丰度发生了一定变化。干旱胁迫时，甘蔗通过改变土壤养分和酶活性间接影响了根际微生物群落的组成，根际微生物的变化可以调节甘蔗的酶活性和光合作用，进而影响宿主植物对干旱的适应性。

图2 优势物种相对丰度及与环境因子相关的dbRDA度分析

(A)   优势物种的相对丰度柱状堆叠图。(B)不同品种、干旱胁迫、环境因素和优势菌群之间基于距离的冗余分析

图3 共线性分析结果

(A)共现网络图，(B)不同处理下聚集模块中OTUs丰度，(C)不同处理下核心菌群结果

参考文献：

Liu Q, Zhao X, Liu Y, Xie S, Xing Y, Dao J, Wei B, Peng Y, Duan W, Wang Z. Response of Sugarcane Rhizosphere Bacterial Community to Drought Stress. Front Microbiol. 2021 Oct 6;12:716196.

案例2：解析银暴露形式对土壤微生物组的作用

发表期刊：Journal of Hazardous Materials

影响因子：10.584

发表时间：2021. 7. 29

研究目的：研究添加Ag₂SNPs（硫化银纳米颗粒）或是AgNO₃对土壤微生物群落的影响

研究样本：土壤

研究方法：16S测序

样本数量：18个（3个处理×2个时间点×3个重复）

研究设计：

试验分为三组：未暴露的土壤（对照-CT），添加10 mg/kg土壤AgNO3的土壤（离子对照）和添加10 mg/kg土壤Ag₂SNPs 的土壤。在暴露14天和28天后，从每个处理条件下的三个岩心的表层土壤（岩心深度=0 - 4 cm）中采集土壤样本（0.25 g）。然后用16S测序分析不同处理土壤的微生物群落变化并预测微生物组功能，也分析了氮循环相关的功能基因的变化（图1）。

图1 研究设计

研究结论：

在复杂的暴露情景下，Ag₂SNPs 和AgNO₃处理会改变土壤微生物群的结构。功能分析还表明，参与不同代谢的基因丰度发生了显著变化，导致了与S、N和C循环相关的关键土壤功能的失衡。

图2 在银暴露14d（A）或28d（B）后，不同处理土壤中的15 种最丰富菌纲的相对丰度

图3 在银暴露14 d（A）或28 d（B）后，受Ag2SNPs 或AgNO3处理显著影响的菌属的相对丰度

参考文献：

Peixoto S, et al. The impact of silver sulfide nanoparticles and silver ions in soil microbiome. J Hazard Mater. 2022 Jan 15;422:126793.

案例3：水稻驯化过程对根际微生物组功能潜力的影响

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2022.01

研究目的：探究水稻驯化过程对根际微生物组的甲烷代谢的影响

研究样本：根际土壤

研究方法：宏基因组测序

样本数量：10个品种×5个重复+1个品种×4个重复，共54个

研究设计：

本研究共有三种野生稻，非洲野生稻Oryza barthii、亚洲普通野生稻Oryza rufipogon和尼瓦拉野生稻Oryza nivara及两种栽培稻，非洲栽培稻Oryza glaberrim和亚洲栽培稻Oryza sativa。使用一种非洲野生稻（SW42(Af_W1-5)）和一种非洲栽培稻（两个品种LM8(Af_C1-5)和WH20(Af_C6-10)）比较非洲野生稻和栽培稻；使用两种亚洲野生稻，普通野生稻（两个品种SW499(As_W1-5)和SW502(As_W6-9)）和尼瓦拉野生稻（两个品种SW218(As_W11-15)和SW223(As_W16-20)），及一种亚洲栽培稻（4个品种106 indica(As_C1-5)、Meitezhen indica(As_C6-10)、Jiangxi japonica(As_C11-15)和Daohuaxiang japonica(As_C16-20)）用于亚洲野生稻和栽培稻的比较。

试验田大小为2 m x 2 m，采用随机区组设计，间距0.5 m。除普通野生稻品种SW502(As_W6-9)有4个重复，其他均有5个重复。每个样本收获4株开花期植株，轻轻刷洗整个根系收集根际土壤，最后使用0.5 g土壤提取根际微生物组DNA用于宏基因组测序。

研究结论：

通过将非洲和亚洲野生稻分别与其近源栽培种质进行比较，发现野生稻中甲烷生产和利用的关键酶基因和菌群相对丰度都更高，表明野生稻的根际微生物组在甲烷代谢方面保持了更好的生态平衡。

图1 野生稻和栽培稻根际微生物组中甲烷产生相关关键酶基因相对丰度的比较

 图2 野生稻和栽培稻根际微生物组中甲烷氧化相关关键酶基因相对丰度的比较

参考文献：

Tian L, et al. Comparison of methane metabolism in the rhizomicrobiomes of wild and related cultivated rice accessions reveals a strong impact of crop domestication. Sci Total Environ. 2022; 803: 150131.

3.1.2 单组学多对象研究思路

案例4：8分文章揭示两种地貌森林土壤微生物群落组成和相互作用差异

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2022.1.17

研究目的：喀斯特土壤特性不同于非喀斯特土壤，考察细菌和真菌多样性和群落组成对两种森林土壤的作用。

研究样本：土壤

研究方法：16S测序和ITS测序

样本数量：7个县×2类MF×3重复，共42个样本

研究设计：

研究区位于中国西南部贵州省和广西自治区，喀斯特（calcareous lithosols, 石灰土）和非喀斯特 (Haplic Acrisol，碎屑土) MFs (自然恢复成熟林) 位于7个温度和降水梯度上，水城县 , 金沙县, 都匀市, 环江县, 都安县, 马山县和龙州县 。

每个气候梯度在岩溶和非岩溶 MF各有三个地块 (30 × 30 m)，采用S形采样设计中从每个地块 0-15 cm深度收集20个土壤样本，再均质化作为一个重复；共收集了42个样本。土壤通过2 mm 筛子过筛，部分用于基因组DNA提取和测序，其他部分用于检测铵态氮 (NH4⁺)、硝酸盐态氮 (NO^-) 和微生物量及理化性质。

图 1 中国西南地区贵州省和广西自治区 7 个县的现场采样图

研究结论：

通过对七个气候梯度喀斯特森林和非喀斯特森林土壤的研究，发现两种森林之间细土壤细菌和真菌分布以及种间相互作用的差异可能是由于pH、Ca和TN等土壤性质影响。

图2 基于Spearman相关性系数构建细菌和真菌类群之间的共现网络

图3 随机森林模型解释地理、气候和土壤特性对细菌和真菌丰度和多样性的影响

图4 土壤类型和温度对细菌和真菌丰度、多样性、群落组成以及类群之间相互作用影响的概念模型

参考文献：

Xiao D, et al. Comparison of bacterial and fungal diversity and network connectivity in karst and non-karst forests in southwest China. Sci Total Environ. 2022; 822: 153179.

案例5：磷化工业区域农田土壤抗生素耐药的发生情况

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2021.7

研究目的：探究磷化工业区盛行下风方向农田表层土壤中重金属、抗生素抗性基因（ARGs）、可移动遗传元件（MGEs）和微生物群落的变化

研究对象：农田土壤

研究方法：16S测序

样本数量：3条线路×7个距离×3个重复，共63个

研究设计：

采集与磷化工工业区不同距离的农田土壤样本，并进行化学性状、重金属和微生物群的分析。同时，利用qPCR对ARGs和MGEs标记基因进行检测，获得样本中ARGs和MGEs的图谱。

在研究区域（磷化工区）盛行风向东北向西南方向的三条线路采集表层土壤（0-20 cm），分别为20 m（D1）、500 m（D2）、1000 m（D3）、1500 m（D4）、2000 m（D5）、3000 m（D6）、4000 m（D7）（图1）。在每个地点，建立了3个10×10平方米的地块，间隔距离约为10米。在每个样方中，随机抽取3个土壤样本，并合并成一个混合样本。

图1 磷化工区下风区采样点分布示意图

研究结论：

结果表明，Cd胁迫显著提高了ARGs的丰度和质粒介导的结合转移潜能。土壤Cd和MGEs被认为是驱动ARGs变化的主要因素，前者通过改变MGEs丰度和微生物组成对ARGs产生影响。

图2 不同距离土壤样品中ARGs的相对丰度和PCoA分析

图3 Mantel test分析和VPA分析

图4 结构方程模型显示影响ARGs相对丰度的生物和非生物因素

参考文献：

Cheng JH, et al. Occurrence of antibiotic resistome in farmland soils near phosphorus chemical industrial area. Sci Total Environ. 2021 Nov 20;796:149053.

案例6：根际细菌、古菌、真菌是如何影响植物的金属超积累

发表期刊：Science of the Total Environment（IF 7.963）

影响因子：7.963

发表时间：2021.8.30

研究目的：探讨植物-土壤-微生物在TME（微量金属元素）超积累中的相互关系

研究样本：根际土壤、土壤

研究方法：16S测序和ITS测序

样本数量：4个地点×2类土壤×3个重复，共24个样本

研究设计：

选择4个地点采集样本，2个地点是TME污染的土壤（M），分别为M_PL22和M_PL27。2个地点是未受污染的土壤（NM），NM_PL35和NM_PL14。在每个M和NM地点收集受鼠耳芥根际影响的土壤和周围背景土壤，各3个重复。通过16S测序和ITS测序对根际土壤和背景土壤中的微生物，包括细菌、古菌、真菌进行多样性分析，并结合植物和土壤的化学分析，共同探讨植物-土壤-微生物在TME超积累中的相互关系（图1）。

图1 研究设计

研究结论：

金属污染会显著改变土壤细菌/古生菌和真菌群落的结构，并影响鼠耳芥根际招募的独特菌群的数量。此外，锌的超积累主要由生物变量决定，而镉超积累的变异性主要受非生物因素的影响。

图2 A）在根际和背景土壤的四个研究地点观察到的细菌/古生菌和真菌扩增子序列变异（ASV）或类型的数量 B）四个地点微生物群落结构的NMDS排序图

图3 通过PLS回归分析鉴定锌、镉超积累的生物和非生物驱动因素

参考文献：

Kushwaha P, Neilson JW, Maier RM, et al. Soil microbial community and abiotic soil properties influence Zn and Cd hyperaccumulation differently in Arabidopsis halleri. Sci Total Environ. 2022 Jan 10;803:150006.

3.1.3 多组学研究思路

案例7：多组学解析不同类型微塑料对土壤微生物群、功能和代谢组的影响

发表期刊：Journal of Hazardous Materials

影响因子：10.584

发表时间：2021.09

研究目的：评估常规微塑料和可生物降解微塑料对土壤微生物群落组成和功能的可能影响

研究样本：土壤

研究方法：16S测序、宏基因组测序和非靶向代谢组（多组学研究）

样本数量：15个（5处理x3个重复）

研究设计：

取未耕种的土壤样本，风干并去除石头和植物的根后，均质培养。试验设置5个处理组，每组重复3次：对照土壤(CK)、1%LDPE+土壤(PE)、1%PS+土壤(PS)、1%PLA+土壤(PLA)和1%PBS+土壤(PBS)，所有样本培养条件一致。室温培养60 d后，采集土壤样本保存于−80 ℃，用于16S测序，宏基因组测序，以及代谢组分析（图1）。

注：PE—聚乙烯，PS—聚苯乙烯，PLA—聚乳酸酯，PBS—聚丁二酸丁二醇酯

图1 研究设计

研究结论：

本文揭示了传统和生物可降解塑料对土壤微生物群落、功能和代谢组的显著影响。可生物降解的微塑料显著地改变了土壤微生物群落的结构，进而影响环境中的功能。

图2. 不同处理下土壤微生物群落结构。(A)门层级物种相对丰度柱状堆叠图。(B)Alpha多样性指数。(C)基于Bray-Curtis距离矩阵的PCoA图。(D)基于加权UniFrac距离矩阵的PCoA图。

图3. 不同处理下土壤功能基因信息。(A、B)BrayCurtis距离矩阵的KEGG、COG数据库的PCoA图。(C)KEGG通路中不同组间丰度top30的通路及丰度信息。

图4. 土壤代谢组学研究

(A)土壤代谢组的PCA， (B)土壤代谢组的PLS-DA，(C)热图，(D)sPLS-DA分析

图5. 16S、宏基因组及代谢组联合分析结果

参考文献：

Sun Y, et al. Biodegradable and conventional microplastics exhibit distinct microbiome, functionality, and metabolome changes in soil. J Hazard Mater. 2022 Feb 15;424(Pt A):127282.

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3.2 水体和沉积物微生物组研究

案例1：探讨影响湖泊微生物群落结构季节性变化的因素

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2021.09

研究目的：对呼伦湖不同季节水体中的微生物群落及其影响因素进行研究

研究对象：湖水

研究方法：16S测序

样本数量：43个

研究设计：

于2018年夏、冬两季在整个呼伦湖流域的22个采样点采集了43个样本（图1）。夏季和冬季样本分别命名为HL组和WHL组。使用16S测序对样本进行菌群多样性分析，并测定理化指标（如水温、pH、溶解氧等），最后探讨细菌群落与环境因子的关系。

图1 采样示意图

研究结论：

在季节性冰盖的呼伦湖生态系统中，受温度、pH和溶解氧的影响，细菌存在复杂的年周期，alpha多样性具有明显的季节差异，冬季高于夏季。变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是受季节影响最大的菌门。CCA分析表明，温度、pH和溶解氧是影响呼伦湖物种分布的环境因子，这与网络图和环境贡献分析的结果是一致的。

图2 呼伦湖水样夏季和冬季的alpha多样性、ABT和相关性分析

图3 呼伦湖水样群落微生物组成

图4 环境因子分析

参考文献：

Shang Y, Wu X, Wang X, et al. Factors affecting seasonal variation of microbial community structure in Hulun Lake, China. Sci Total Environ. 2022 Jan 20;805:150294.

案例2：海域沉积物微生物群落结构及代谢潜力分析

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2021.11.14

研究目的：人为活动污染对黄河口及周边地区沉积物中的微生物群落组成和功能基因的影响

研究对象：海域沉积物

研究方法：16S测序+功能基因分析

样本数量：33个

研究设计：

研究区位于黄河口地区和莱州湾北部地区。从近岸到近海地区的11个采样点采集沉积物样本（图 1）。在每个采样点，使用采样器收集三个平行的表面沉积物样本（0 - 5 cm）。将样本混合并密封在袋子中，然后用干冰运送回实验室。沉积物样本的一部分储存在 4 °C 用于环境参数分析，其他储存在 -80 °C 用于微生物群落和功能基因分析。

图1 采样地点

研究结论：

通过对黄河口的微生物群落进行了研究，探讨了环境因子对微生物群落和功能基因的影响。RDA和环境因子相关分析表明，水深、Na含量和Ca含量是影响微生物群落的最显著的环境因子。微生物群落可参与各种营养循环，其微生物群落组成和生化过程受环境污染的影响较大。

图2 沉积物中微生物群落的多样性

图3 a与微生物群落有关的环境因素的RDA分析，以及b科水平的物种相对丰度与环境因素的相关性热图

参考文献：

Yin X, et al. Microbial community structure and metabolic potential in the coastal sediments around the Yellow River Estuary. Sci Total Environ. 2022 Apr 10; 816: 151582.

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3.3研究思路和方法小结

从研究组学看，单组学研究仍然占比更高，单组学多对象的研究是趋势。多对象既可以是菌群层面，比如同时研究细菌和真菌群落组成，也可以是基因层面，比如在研究菌群构成的同时，讨论功能基因、ARGs、MGEs等的变化，还可以是研究对象层面，比如既研究根际土壤，也研究周围的土壤，既研究根际土壤，也研究宿主内生菌等；多组学研究对于多维度探讨菌群与环境的互作机制是必不可少的，考虑实验和数据分析的可行性，与宏代谢组的结合，是较常见的搭配。

从研究设计看，双因素或多因素设计越来越常见，比如不同处理×不同时间点，不同地点×不同季节，不同线路×不同距离等；对于只采用不同处理的设计，不同处理的方式也是越来越多，3种或5种以上已较为常见；而对于只是取样地理位置不同的设计，10个以上地点的取样，都不算是多的。

从环境因素看，不管是土壤还是水体，不管是不同采样地点还是不同胁迫刺激，与环境指标的联合分析和讨论是必不可少的，如土壤的理化性质、酶活性、污染物指标等，水体的水温、pH、溶解氧等，植株的营养含量、生理、产量和果实品质等，都是需要认真收集和记录的。

从样本总数和重复数看，根据上述分析，一个环境微生物组研究的样本总数达到40个或50个以上是常规操作；对于样本重复数，至少3次重复，而分组较少的设计，重复数达到5个或是10个以上的，也都是合情合理的。需要说明的是，从数据分析的角度，每个分组有5个以上的样本重复是更为合理的，当出现个别样本因自身、采集和保存、实验、或是其他原因导致数据没产出或是不能用时，也不会影响到整体的分析。

参考文献：

1.    Jones MD, Crandell DW, Singleton DR, Aitken MD. Stable-isotope probing of the polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterial guild in a contaminated soil. Environ Microbiol. 2011 Oct;13(10):2623-32.

2.    Peng J, Zhang Y, Su J, Qiu Q, Jia Z, Zhu YG. Bacterial communities predominant in the degradation of 13C(4)-4,5,9,10-pyrene during composting. Bioresour Technol. 2013 Sep;143:608-14.

3.    Zhu YG, Yoshinaga M, Zhao FJ, Rosen BP. Earth Abides Arsenic Biotransformations. Annu Rev Earth Planet Sci. 2014 May 1;42:443-467.

4.    Jia Y, Huang H, Chen Z, Zhu YG. Arsenic uptake by rice is influenced by microbe-mediated arsenic redox changes in the rhizosphere. Environ Sci Technol. 2014 Jan 21;48(2):1001-7.

5.    Fu SM, Hartung J, Zhou CY, Su HN, Tan J, Li ZA. Ultrastructural Changes and Putative Phage Particles Observed in Sweet Orange Leaves Infected with 'Candidatus Liberibacter asiaticus'. Plant Dis. 2015 Mar;99(3):320-324.

6.    Wei Z, Gu Y, Friman VP, Kowalchuk GA, Xu Y, Shen Q, Jousset A. Initial soil microbiome composition and functioning predetermine future plant health. Sci Adv. 2019 Sep 25;5(9):eaaw0759.

7.     Benmalek, Y., Fardeau, ML. Isolation and characterization of metal-resistant bacterial strain from wastewater and evaluation of its capacity in metal-ions removal using living and dry bacterial cells. Int. J. Environ. Sci. Technol. 2016 July, 2153–2162 .

8.    Park S , Kim H K , Kim D H , et al. The effectiveness of injected carbon sources in enhancing the denitrifying processes in groundwater with high nitrate concentrations[J]. Process Safety and Environmental Protection, 2019, 131(3).

9.    Gibert O, Assal A, Devlin H, Elliot T, Kalin RM. Performance of a field-scale biological permeable reactive barrier for in-situ remediation of nitrate-contaminated groundwater. Sci Total Environ. 2019 Apr 1;659:211-220.

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