NC：淋巴管内皮细胞核lncRNA LETR1调控细胞增殖和迁移 | 转录专题

论文标题：LETR1 is a lymphatic endothelial-specific lncRNA governing cell proliferation and migration through KLF4 and SEMA3C

刊登日期：2021-02-10

发表杂志：Nature communications

影响因子：17.694

研究机构：Swiss Federal Institute of Technology

文献地址：10.1038/s41467-021-21217-0

前言

血液和淋巴血管系统对于运输氧气、营养物质、信号分子和白细胞进出外周组织、维持体内稳态有着重要意义。血管网络的激活增加或功能受损是许多病理状况的标志。

最近研究发现lncRNA比mRNA 表现出更高的组织特异性，说明它们在调节细胞类型特异性基因表达过程中扮演重要角色，并且有研究发现一些lncRNA在血管生成、肿瘤诱导的血管生成和增殖以及内皮细胞的细胞连接调节中发挥作用。但淋巴管内皮特异性lncRNA并没有迄今为止还没有人研究。

作者通过RNA-Seq和CAGE-Seq分析确定了与LEC和BEC相关的谱系特异性 lncRNA。鉴定出了一种淋巴内皮特异性lncRNA，并对其作用及作用机制进行了研究。

结果

1

鉴定血管谱系特异性 lncRNA

首先作者通过qPCR对LEC和BEC进行了鉴定，随后通过RNA-Seq 和 CAGE-Seq对LEC和BEC进行测序，并且引入了新生儿原代真皮成纤维细胞（DF）的数据。通过两两比较，并取交集得到了142个LEC和160个BEC特异性lncRNA（图1a-d）。随后通过注释工具对这些特异性IncRNA进行分类，发现在lncRNA中占比最大的是基因间lncRNA（图1e-f）。

2

通过ASOs鉴定lncRNA的候选功能

接下来作者首先筛选出有保守转录起始区域和外显子区域的lncRNA，随后筛选出TSS和DHS重叠的lncRNA，最后通过RNA-Seq和CAGE-Seq中的表达水平进行筛选，一共鉴定出5个LEC和12个BEC lncRNA。作者选择了2个LEC IncRNA（AL583785.1和LETR1）和 2个BEC lncRNA（LINC00973 和 LINC01013）（图2a-c）。通过qPCR检测发现婴儿和成人皮肤样本的LEC和BEC之间存在差异表达（图2d、e）。使用流式细胞术分选人类健康皮肤中的LEC和BEC，并用qPCR分析了四种候选lncRNA和特定血液和淋巴标志物在LEC和BEC中的表达水平，发现两种EC和两种BEC lncRNA在各自的细胞类型中有更高的表达量（图2f、g）。通过细胞分级分离法和qPCR分析了这四种IncRNA在LEC和BEC中的亚细胞定位，AL583785.1在细胞质和细胞核之间几乎均匀分布，而LETR1、LINC00973 和 LINC01013 都主要位于细胞核中（图2h、i）。

3

lncRNLETR1-ASOKD后的转录谱显示了LETR1在细胞生长、细胞周期进程和迁移中的潜在功能

作者通过敲低4种IncRNA后再进行CAGE-Seq，发现LEC中AL583785.1和BEC中LINC00973和LINC01013的ASO 敲低后基因表达的变化不明显。而敲低LETR1之后对LEC转录组有很大的影响，导致133个基因上调和122个基因下调。通过GO分析发现上调基因主要参与细胞死亡、炎症信号传导和对外部刺激的反应，而下调基因主要与细胞迁移和趋化性的调节有关（图3a-d）。

通过基序活性响应分析，发现了 19 个上调和 7 个下调的基序。基于 MARA 分析，接下来又用255个受LETR1-ASOKD影响的基因重建了一个基因调控网络，发现了与内皮细胞增殖和迁移相关的基因，如VEGFA、MAFF、ANGPT2、RASD1、PROX1、SEMA3C和ROBO1（图3e、f）。

这些结果表明，LETR1敲低后影响TF调控网络从而对LEC的转录组产生重大影响，这些靶向基因都是些内皮细胞分化、增殖和迁移的必需基因。

4

LETR1是在LEC中表达三个主要转录本中真正的lncRNA

作者对LETR1的潜在编码特性进行研究。根据数据库得到，LETR1转录19种不同的外显子组合。通过CPAT和PhyloCSF证实了这19种转录变体都是非编码性质的。通过3 ' RACE对LEC中的LETR1的亚型进行表征，鉴定得到三个LETR1的转录本，经证实，所有三种转录本都不能产生任何蛋白。通过qPCR对三个LETR1转录本的表达分析显示 LETR1-1是LEC中最具代表性（图4a-f）。

5

敲除LETR1会降低LEC细胞生长、细胞周期进程和细胞迁移

为了研究LETR1-ASOKD对LEC生长的潜在影响，作者通过动态成像分析进行了细胞生长测定，发现LETR1-ASOKD抑制了LEC的细胞生长。同时为了研究细胞生长表型是否不是由于ASOs的脱靶效应造成，作者还进行了CRISPR敲低后的细胞生长测定，发现LETR1的CRISPRi-KD也显著降低了LECs的生长速度。然而，由于敲除效率较低，其作用不如ASOKD显著（图5a、b）。通过流式细胞术发现LETR1-ASOKD后在G0时期中的LEC的百分比显著增加（图5c、d）。通过创面闭合实验（划痕实验）发现LETR1-ASOKD的LEC迁移显著减少（图5e、f）。慢病毒过表达LETR1，发现可以缓解敲低LETR1所引起的细胞增殖和迁移的抑制（图5g、h）。

6

LETR1是一个核lncRNA，与差异表达基因子集附近的DNA区域反式相互作用

在培养的LEC中进行了RNA荧光原位杂交，发现LETR1主要定位在培养的LEC的细胞核中，这表明LETR1可能在体内发挥染色质相关功能（图6a、b）。

随后作者又进行了Pull down实验，并对DNA进行测序，发现LETR1有2258个结合位点，为了鉴定由LETR1直接调控的候选基因，分析了LETR1结合位点的基因组分布。得到 1607个蛋白质编码基因，这些基因在其启动子、外显子或内含子中至少有一个LETR1结合位点。其中有1193个基因在LEC中表达，随后与LETR1-ASOKD上的 255个差异基因取交集，一共得到44个基因（12个上调和 32个下调）。并且这44个基因在不同的染色体上，表明LETR1具有主要的反式调节作用。44个基因其中29个在LEC中表达下调基因但在BEC中表达上调基因，暗示这些基因是LETR1的潜在下游靶基因（图6c、d）。

使用MEME分析确定了两个显著富集的基序，表明LETR1与基因组 DNA 的相互作用可能通过不同的 DNA 基序发生。通过比较基序分析发现LETR1基序与之前MARA鉴定的几个TF结合位点有显著的相似性（图6E、F）。结果显示，LETR1通过影响的TF调控网络从而成为调控LEC转录组的关键因子。

7

LETR1通过KLF4和SEMA3C调节细胞增殖和迁移

在LETR1的44个下游靶基因中，作者将重点研究KLF4、SEMA3C。其中KLF4与细胞增殖相关，SEMA3C与增强内皮细胞的迁移相关。LETR1-ASO2敲低导致KLF4上调，同时在G0时期LEC增加。LETR1和KLF4同时敲低可以g0时期LEC减少，但是这种作用有一定的限度（图7b、c）。随后又分析了LETR1敲低，但SEMA3C过表达对LEC的迁移的改变。发现单独敲低 LETR1会导致 SEMA3C下调，细胞的迁移减少。但在LETR1敲低后，又使SEMA3C过表达发现细胞迁移能力显著恢复，而单独的SEMA3C过表达不影响LEC的细胞迁移能力（图7d、e）。

8

LETR1 与几种蛋白质复合物相互作用以发挥其转录调节功能

作者通过pull down和质谱分析有哪些可能与LETR1相互作用的蛋白质，通过筛选一共发现59个蛋白质与LETR1有相互作用关系，这59个蛋白质中有很大一部分与RNA处理功能有关（图8a）。随后分析了59种与LETR1相互作用的蛋白在LEC与BEC中的RNA表达。发现了四个蛋白质（DDX39A、NUMA1、RBBP7和DDX5）（图8b）。其中作者对组蛋白结合蛋白RBBP7比较感兴趣，因为之前的研究发现它参与了许多细胞功能的调节，包括增殖和迁移。于是通过RNA免疫沉淀实验发现了RBBP7和LETR1之间的相互作用，表明RBBP7是LETR1基因调节功能的媒介。

作者在LETR1敲低样本中分析了RBBP7在KLF4和SEMA3C的TSS以及LETR1结合位点的富集量，发现LETR1的敲低显著降低了KLF4和SEMA3C启动子处的RBBP7和RNA Pol II的富集量。但只降低了KLF4中LETR1结合位点处RBBP7的富集量，并且在之前的研究中作者发现LETR1与靶基因组区域的结合可能涉及三链体形成，所以这里的降低可能是有三链体导致（图8g、h）。

在组蛋白修饰水平上，敲低LETR1 仅影响 H3K4me3 修饰，尤其是在SEMA3C的TSS。然而，在LETR1-ASO2 敲低后，H3K27me3 水平没有改变（图8i、j）。

综上所述，这些结果表明，LETR1通过RBBP7介导RNA Pol II的富集，并在一定程度上介导靶基因转录位点的染色质组织，从而发挥转录调控作用。

结果

本研究通过RNA-Seq和CAGE-Seq确定了人类真皮淋巴和血管内皮细胞中特异性lncRNA的图谱，并通过LETR1的功能表征强调了lncRNA在调节特异性内皮细胞功能方面的重要性。

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