用户文章PBJ：BBX-miR-MYB调控苹果皮中原花青素合成| 转录调控专题

论文标题：The MdBBX22–miR858–MdMYB9/11/12 module regulates proanthocyanidin biosynthesis in apple peel

刊登日期：2022年05月

发表杂志：Plant Biotechnology Journal

影响因子：13.263

研究机构：西北农林科技大学园艺学院，陕西苹果工程技术研究中心，陕西省生物资源重点实验室

技术手段：miRNA测序、联川生物Omicstudio云平台

文章架构：

主要研究内容：

1. mdm-miR858的表达与苹果皮发育过程中PA积累呈负相关

图1

对盛花后30、60、90、120、140天的苹果皮类黄酮含量进行测定，苹果皮中的儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2和总PA的含量均随着时间增长表现出降升降趋势（图1a, 1b）。通过miRNA测序构建miRNA表达谱，鉴定出5106个独特的成熟miRNA，其中有188个miRNA的表达量与PA含量负相关（图1c）。靶基因预测后，只有mdm-miR858的靶基因MdMYB9/11/12参与类黄酮合成。利用qPCR对mdm-miR858表达模式进行了验证，并发现MdMYB9/11/12与mdm-miR858的表达模式相反，与PA含量变化一致（图1d, 1e）。表明mdm-miR858的表达与苹果皮中PA的积累呈负相关。

2. MdMYB9/11/12是mdm-miR858的靶基因

图2

经过5′-RACE克隆后，检测到mdm-miR858在碱基互补配对区域的第10和第11个碱基上切割靶基因MdMYB9/11/12（图2a）。随后将含有GUS报告基因的重组载体通过农杆菌介导的转化体系引入烟草叶片，当mdm-miR858与MdMYB9/11/12共转化到烟草叶片时，GUS染色变浅（图2b）。通过荧光分光光度计测定，发现这个片区域的GUS含量显著减少（图2c）。结果表明mdm-miR858靶向负调控MdMYB9/11/12。

3. mdm-miR858靶向MdMYB9/11/12以调节下游结构基因的表达

图3

前人研究发现MdMYB9/11/12可以与MdbHLH33和MdbHLH3结合以促进结构基因MdANR和MdLAR的表达。作者通过瞬时荧光酶测定，发现将MYB9/11/12、bHLH33和ANR共转化到烟叶后表现出较强的荧光。荧光素酶（LUC）活性测定的结果与表型观察结果相似。这表明miR858靶向MdMYB9/11/12以调节下游结构基因的表达。

4. mdm-miR858靶向MdMYB9/11/12以抑制苹果愈伤组织中PA的积累

图4

为了研究miR858和MYB9/11/12对苹果皮PA积累的调控作用，作者构建了苹果皮MYB9/11/12的瞬时过表达愈伤组织，并被DMACA染成紫色，表明含有大量原花青素，同时过表达miR858的愈伤组织被DMACA染色后颜色没变化（图4a）。qPCR测定发现，瞬时过表达mdm-miR858和MYB9/11/12的愈伤组织中MYB9/11/12表达量显著降低，miR858表达量显著增加，表明miR858抑制了MYB9/11/12的表达（图4b）。HPLC分析发现MYB9/11/12愈伤组织中的这些类黄酮含量均高于野生型愈伤组织，过表达miR858后类黄酮含量又显著降低（图4c）。

5. mdm-miR858靶向MdMYB9 /11/12以抑制拟南芥中的PA积累

图5

拟南芥TT2基因可以编码R2R3-MYB蛋白从而调节拟南芥种子中原花青素的积累。拟南芥TT2突变体种皮为浅黄色，将MdMYB9/11/12在TT2突变体中过表达后，种皮颜色变为棕色，并被DMACA染成蓝黑色；过表达miR858后种皮颜色无变化，经DMACA染色也无变化，表明MdMYB9/11/12可以促进拟南芥种子原花青素积累，而mdm-miR858抑制了MdMYB9/11/12对原花青素合成的促进作用（图5a）。通过半定量PCR检测，发现过表达miR858抑制了MYB9/11/12表达（图5c）。qPCR测定发现过表达miR858也抑制了类黄酮生物合成相关基因的表达（图5d）。这也验证了愈伤实验中得出的结论，即miR858靶向调控MYB9/11/12从而抑制原花青素积累。

6. MdBBX22与mdm-miR858启动子结合并诱导其表达

图6

通过构建酵母单杂交文库，筛选出与miR858互作的蛋白BBX22。为了研究BBX22是否可以激活miR858的转录，将miR858启动子和LUC报告基因融合。然后将BBX22与miR858pro共转化到烟叶后明显提高了荧光强度。表明BBX22正向调控miR858（图6a, 6b）。

然而，与pGADT7-MdBBX22和mdm-miR858m pro-HIS2共同转化的酵母细胞在相同条件下不生长（图6c）。该结果表明，MdBBX22能够与mdm-miR858启动子中的G-box基序结合。EMSA结果进一步支持了这一结果（图6d）。随后作者利用CHIP-PCR技术将BBX22融合到GFP序列标记的CDS中并被过表达，结果发现过表达BBX22明显增强了对含有G基序的miR858启动子片段S3的检测丰度。这些结果表明BBX22与miR858启动子在体内结合（图6c-e）。

7. MdBBX22通过促进mdm-miR858的表达来抑制MdMYB9/11/12诱导的PA积累

图7

为了进一步验证MdBBX22诱导mdm-miR858的表达抑制PA合成，作者将MdBBX22在MdMYB9/11/12愈伤组织中过表达后被DMACA染成淡粉色（图7a）。qPCR测定发现愈伤组织中的MdBBX22和mdm-miR858表达量增加（图7b）。经过HPLC分析，发现在MdMYB9/11/12-OX愈伤组织中过表达MdBBX22可使原花青素含量降低（图7c）。表明MdBBX22通过促进mdm-miR858的表达抑制了MdMYB9/11/12诱导的原花青素积累。

8. MdBBX22诱导mdm-miR858的表达，抑制PA积累，改变新陈代谢，增强苹果皮中花青素的合成

图8

由于MdBBX22是苹果中的光响应转录因子。因此推测：MdBBX22可能通过调节mdm-miR858的表达来影响光胁迫下的PA积累。作者将同一生长期的苹果连续光照，随着光照时间增加，总PA含量逐渐降低，而花青素含量在12h后逐渐增加。qPCR测定后也发现MdBBX22和mdm-miR858在光胁迫下表达增加，MdMYB11/12的表达量在光胁迫下显著降低（图8a, 8b）。在苹果皮中过表达MdBBX22可使mdm-miR858表达量以及花青素含量显著增加，而MdMYB11/12的表达以及总PA的含量显著降低。苹果皮中注射pTRV2-MdBBX22使MdBBX22沉默后得到了相反的结果（图8c-f）。这些结果表明，MdBBX22诱导mdm-miR858的表达，并抑制光胁迫下苹果皮中PA的积累。

上述实验中花青素和总PA含量的变化模式相反，这促使我们推测：在光胁迫下抑制PA途径可能有助于花青素的快速合成。为了验证这一假设，作者在苹果皮中注射mdm-miR858过表达载体和MdMYB11/12沉默载体，发现MdMYB11/12表达量显著降低，总PA含量降低，花青素含量增加。随后作者构建了STTM858载体，将STTM858载体转染到愈伤组织后，发现miR858表达量显著降低，花青素含量降低，而总PA含量增加（图8c-f）。这些结果表明，在光胁迫下抑制PA途径有助于花青素的快速合成。

总结

该研究结果表明，mdm-miR858可以靶向MdMYB9/11/12从而抑制PAs的积累。在光胁迫下，BBX22与miR858启动子结合，诱导miR858表达，通过靶向MYB9/11/12抑制原花青素积累和促进花青素合成，揭示了转录后水平上 PA 合成的新调控机制。PA和花青素在光胁迫下表现出竞争关系，抑制PA积累有助于花青素的快速合成。

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