Adv Sci（IF=17.5）：METTL14介导的m6A修饰减弱MAVS蛋白表达调节抗病毒免疫| m6A专题

论文标题：甲基转移酶样蛋白14通过N6-甲基腺苷修饰减弱线粒体抗病毒信号蛋白表达负调节抗病毒免疫

刊登日期：2021年8月

发表杂志：Advanced Science

影响因子：17.52

研究机构：山东省感染与免疫重点实验室，山东大学生物医学学院免疫系

Po点背景

m⁶A（N⁶-methyladenosine）是一种最常见的mRNA修饰，可调节基因表达并调节包括代谢、肿瘤恶化、生物钟和DNA损伤在内广泛的生物活动。据报道m6A修饰通过直接引导干扰素 α (IFNA) 和干扰素β (IFNB) mRNA的快速转换，作为I型IFN 反应的非活性调节剂，在先天抗病毒免疫中发挥重要作用。

线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是先天免疫反应RLRs信号通路中的重要信号分子，它是一种线粒体整合外膜锚定蛋白。病毒感染后，MAVS迅速在线粒体膜上形成非常大的聚集体，激活下游I型干扰素和其他抗病毒分子的产生。据报道，MAVS受到磷酸化、泛素化等多种翻译后修饰的调节。但是，MAVS能否通过m6A修饰来调节尚不清楚。

本文中，作者证明Mettl14介导Mavs mRNA的m6A修饰可以直接降低Mavs mRNA 的稳定性和表达，调节下游TBK1、IRF3磷酸化和IFN-β合成，以负调控抗病毒先天免疫。

Show点干货

1.METTL14介导的m⁶A修饰抑制RLR诱导的先天免疫信号传导

图1

作者通过CRISPR/Cas9技术获得整体m6A修饰水平大幅降低的Mettl14 +/- 小鼠腹腔巨噬细胞（PM）（图1A、B）。利用仙台病毒（SeV）、脑心肌炎病毒（EMCV）侵染和5′-pppRNA模拟侵染后，Mettl14 +/- PM中Ifnb1、Il6和Ifna4 mRNA水平显著升高，同时 IFN-β 和IL6的蛋白表达显著升高（图1C），IRF3和TBK1的磷酸化水平也有所增加（图1D、E）。另一方面，SeV诱导的IRF3和TBK1的磷酸化水平在METTL14超表达后被抑制（图1I、J）。以上结果表明METTL14介导的m6A修饰抑制RLR诱导的先天免疫信号传导，并且调节多种细胞抗病毒因子的产生。

2.METTL14负调控线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的表达

为了进一步鉴定METTL14介导的m⁶A修饰调节的RLRs信号分子，作者检测了RLRs信号通路中关键分子的表达。

图2

Mettl14 +/+ PM和Mettl14 +/- PM感染SeV/EMCV后，RIG-1/MDA5的表达增加，TBK1/IRF3的表达没有变化。另一方面，MAVS在Mettl14 +/+ PM中的表达没有变化，但是在Mettl14 +/- PM中表达显著上升（图2A）。METTL14负调控细胞感染病毒后MAVS的表达，而这有可能是METTL14作为甲基转移酶调控m6A修饰来完成的。

作者对METTL14如何调节 MAVS 蛋白表达进一步研究，RIG-I、MAVS、TBK1和IRF3的蛋白降解曲线显示：Mettl14 +/- PM的降解曲线与Mettl14 +/+ 细胞相比并没有显著差异，这表明METTL14并非通过降低包括MAVS在内的RLRs通路信号蛋白的稳定性来负调控细胞感染病毒后MAVS的表达（图2B、C）。

3.METTL14促进线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）mRNA的降解

那么METTL14是否可能通过促进MAVS mRNA的降解来负调控MAVS的蛋白表达呢？

图3

图4

SeV感染的Mettl14 +/- PM中，METTL14的敲除并不会影响RLRs通路中Ddx58（RIG-1）/Tbk1/Irf3的表达，但是能够显著增加Mavs和Ifnb1的表达（图3A），而ifnb1是已知的m⁶A靶点。另一方面，Mettl14 +/- PM、Mettl14 +/- 髓性巨噬细胞（BMDM）受转录抑制处理后的mRNA降解曲线显示，METTL14的敲除/敲低提高了Mavs mRNA的稳定性（图3B、C）。相反地，过表达METTL14降低了Mavs mRNA的稳定性（图3D、E）。这表明METTL14通过促进MAVS mRNA的降解来降低其表达。

为了进一步排除METLL14通过影响转录启动负调控MAVS蛋白的表达，作者将5-乙基尿苷处理感染SeV的Mettl14+/- PM，结果显示RLRs通路中的Dhx59(RIG-1)、Mavs、Tbk1和Irf3的新生RNA并未显著降低（图4F），这表明METTL14并非通过抑制包括MAVS在内的RLRs信号分子的转录来负调控MAVS蛋白的表达。

以上结果表明，METTL14作为一种甲基转移酶，通过转录后调控降低了MAVS mRNA的稳定性及其表达水平，从而负调控MAVS蛋白的表达。

4.METTL14催化Mavs mRNA 的 m⁶A 修饰

于是作者提出一个假设，METTL14是否介导MAVS mRNA的甲基化修饰，从而降低MAVS mRNA的稳定性及其表达水平？

图5

m⁶A-seq测序结果表明，Mavs mRNA的stop codon附近存在m⁶A修饰位点（图5A）。RIP-qPCR结果显示Mettl14+/- PM在感染SeV后Mavs mRNA的m⁶A修饰显著减少（图5B）。作者还构建了两个Luciferase miRNA表达报告载体，与Mavs-WT表达报告载体相比，Mavs-MUT 表达报告载体将CDS中的m⁶A motif的GGACC突变为GGTCC。结果显示，HEK-293T细胞表达野生型Flag-METTL14能够显著抑制Mavs-WT的荧光素酶活性，并且这种抑制活性在Mavs-MUT中消失。

以上的结果证明，METTL14介导的MAVS稳定性和先天免疫信号传导的调节依赖于甲基转移酶激活和Mavs mRNA上推定的m⁶A位点。

5.METTL14抑制细胞对 RNA 病毒的抗病毒反应

图6

图7

RLRs 介导的 IFN-β 产生在抗RNA病毒免疫反应中起重要作用。Mettl14+/- PM感染VSV后，Ifnb1 mRNA水平显著升高（图6A、B）。相反地，Flag-METTL14的过表达显著促进了VSV的复制，并且Ifnb1 mRNA水平显著降低（图6C、D、E）。结合HEK293细胞中的实验结果（图7F、G），作者有力地证明METTL14能够抑制细胞通过干扰素-β介导的对RNA病毒-VSV的抗病毒反应。

6.METTL14在体内负调节RNA病毒抗病毒反应

图8

最后，作者在小鼠体内验证了METTL14对RNA病毒抗病毒反应的负调控。

Mettl14+/-小鼠感染VSV后并且相比于Mettl14+/+ 小鼠，存活率高显著升高，肺损伤较小（图8A、B）；血清中的INF-β含量显著升高，并且肺、肝脏、脾脏中的Ifnb1 mRNA水平显著增加（图8C、D）。对应的，Mettl14+/-小鼠的肺、肝脏、脾脏中VSV的mRNA水平和病毒滴度显著低于Mettl14+/+ 小鼠，VSV的复制受到显著抑制（图8E、F）。METTL14有助于小鼠体内的VSV复制，在体内负调节RNA病毒抗病毒反应。

最后一句

作者发现了一种调节I型干扰素的保守进化机制，METTL14对线粒体抗病毒信号蛋白Mavs mRNA的131246518位点进行m⁶A修饰，损害Mavs mRNA的稳定性，并降低其表达，由此负调节RLR诱导的先天免疫。

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