综述：m6A修饰在植物发育与mRNA代谢中的作用 | m6A专题

论文标题：N6-methyladenosine modification underlies messenger RNA metabolism and plant development

刊登日期：2021年10月

发表杂志：Current Opinion in Plant Biology

影响因子：7.843

发表机构：新加坡国立大学

摘要

RNA修饰构成了生物体中基因调控的重要层面。作为真核生物mRNA最普遍的碱基修饰之一，m6A存在于许多植物中，并且需要进化上保守的甲基转移酶Writers、去甲基化酶Erasers和m6A阅读器Readers来写入、擦除和读取m6A修饰。在植物中，m6A影响mRNA代谢的许多方面，包括选择性多聚腺苷酸化、二级结构稳定性、翻译和RNA降解，这是各种植物发育过程和应激反应的基础。本文将要讨论在理解m6A修饰在mRNA代谢中的作用及其与植物发育和应激反应的机制联系方面的最新进展，此外还强调了一些m6A研究在植物中部分还未决的问题。

前言

转录后或共转录RNA修饰是大多数真核细胞的常见生物学过程，其中RNA经历化学修饰，进而影响RNA代谢的多个方面。越来越多的证据表明，信使RNA(mRNA)修饰已成为基因调控的重要层，并在广泛的细胞和发育过程中发挥关键作用。在超过160种不同的RNA修饰[1]中，m6A是mRNA上最丰富的碱基修饰之一，已在病毒和真核生物中发现，例如酵母、哺乳动物、昆虫和植物[2、3]。m6A修饰是可逆的，需要进化上保守的m6A甲基转移酶、去甲基化酶和阅读器的活性来对碱基分别进行碱基修饰、修饰移除和m6A碱基修饰识别等功能。

m6A通过称为m6A writers的多组分甲基转移酶复合物结合在靶RNA上。哺乳动物m6A writers复合物包括METTL3[4]、METTL14[5]、KIAA1429/VIRMA[6、7]、WTAP[8]、HAKAI[7]、ZC3H13[9]和RBM15[10]。模式植物拟南芥具有与METTL3相似的同源蛋白MTA[11]、MTB（METTL14的同源家族蛋白）[12]、VIRILIZER（KIAA1429/VIRMA的同源家族蛋白）[12]、FIP37（WTAP的同源家族蛋白）[13]和HAKAI[12]。然而，植物体内的m6A writers复合蛋白是否包括ZC3H13和RBM15等同源蛋白家族仍然有待进一步研究。

m6A修饰的全转录组图谱揭示了RRACH(R=A/G;H=A/C/U)作为拟南芥中最显著富集的motif[13-15]，这个发现与哺乳动物和酵母中的RRACH motif结果相似。m6A主要富集在终止密码子Stop codon和3' UTR附近，而在5'UTR或其他区域也有沉积[13-16]。然而有趣的是，不同的植物组织可能表现出不同的m6A分布模式[17,18]。

在水稻（Oryza sativa）中，m6A修饰主要富集在叶片和愈伤组织的3'UTR和CDS区，而在穗部的m6A修饰主要富集在3'UTR[17]。这就提出了一个有趣的问题，即m6A的目标特异性如何在不同的发育环境中受到调节。

在哺乳动物细胞中，m6富集依赖于转录因子将writers招募到目标启动子，例如SMAD2/3转录因子，其在转化生长中与METTL3、METTL14和WTAP相互作用并促进与SMAD2/3诱导的mRNA的结合因子β信号传导[19]。此外，表观遗传修饰也影响m6A富集。已有研究表明，组蛋白H3赖氨酸36三甲基化(H3K36me3)在小鼠中介导m6A修饰共转录[20]。同样，m6A修饰也富集在拟南芥H3K36me2位点附近[21]，暗示组蛋白修饰与植物中的m6A甲基化之间存在潜在联系。

m6A修饰是可逆的，可以通过m6A去甲基酶或erasers去除。AlkB家族的两个成员，ALKBH5和FTO，负责哺乳动物中的m6A去甲基化[22,23]。AlkB同源蛋白已广泛存在于植物中，包括叶绿素、苔藓植物、裸子植物、被子植物等[24]。在这些同源物中，拟南芥中的ALKBH10B和ALKBH9B以及番茄中的SlALKBH2已显示介导m6A去甲基化修饰作用[25-27]。

识别腺嘌呤上的m6修饰需要YT521-B同源性(YTH)结构域蛋白或其他RNA结合蛋白的活性，包括异质核核糖核蛋白(HNRNP)和胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白(IGF2BP)蛋白质家族，统称为m6A阅读器[28-34]。YTH结构域蛋白通过YTH结构域直接结合m6A并影响mRNA剪接、出核、RNA稳定性、翻译和其他RNA加工事件[28-35]。拟南芥中有13个编码YTH结构域蛋白的基因，包括ECT1-11、CPSF30L和AtYTH11[36]，其中ECT2-4和CPSF30L已被证明介导m6A识别并参与激活拟南芥下游各种信号通路涉及各种发展和信号过程[37-42]。然而，其他RNA结合蛋白在拟南芥等植物中的同源蛋白是否介导m6A识别仍需继续深入研究。

在这篇综述中，作者讨论了在理解m6A mRNA代谢中的作用及其与植物中各种发育过程或应激反应机的最新进展。此外作者还展望了植物中m6A研究的未来前景，包括m6A表观转录组在未来作物改良中的潜在应用。

（画外音，本综述发表后不久，来自北京大学的贾桂芳课题组喻琼博士便在2021年8月Nature Biotechnology上在线发文，利用外源性导入的FTO将水稻的产生提升了50%，详情点击NBT | 贾桂芳/何川/宋宝安等利用m6A去甲基化酶FTO使水稻产量增加50%（含专家点评） | m6A专题）

mRNA代谢中的m6A修饰

m6A影响mRNA代谢的多个方面，例如mRNA剪接、降解、选择性多聚腺苷酸化、折叠、出核转运和翻译，其中影响mRNA稳定性是迄今为止m6A在植物中最典型的作用。一些研究表明，m6A修饰导致植物中特定转录本的mRNA不稳定。FIP37介导的m6A甲基化导致拟南芥中其靶转录物的mRNA稳定性降低（案例解析：拟南芥m6A甲基化酶FIP37调控茎尖分生组织发育 | m6A专题）[13]（图1a），而ALKBH10B介导的拟南芥中的m6A去甲基化（案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）[25]（图1b）。

同样的SlALKBH2介导的番茄中的m6A去甲基化增加了其靶mRNA的稳定性（DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）[27]（图1c）。这些观察结果与动物研究一致，表明m6A可能影响mRNA不稳定性[5, 13, 25, 27, 43]。

然而，其他几项研究也暗示了m6A修饰对增强mRNA稳定性的影响。MTA和VIR介导m6A修饰导致转录本丰度的整体减少，表明m6A在稳定mRNA中的作用[14,15]。RNA稳定性的这种提高可能与m6A位点周围的m6A抑制核糖核酸裂解有关[14]。此外，m6A阅读器ECT2和CPSF30L在转录稳定中也发挥着调节作用，因为敲除ECT2和CPSF30L会降低其各自靶标的稳定性[37,41]。

m6A修饰机制的矛盾结果表明，植物mRNA稳定性的刺激和抑制作用可以反映m6A修饰的mRNA在不同细胞类型或不同发育环境中的不同细胞命运，这可能由不同的m6A阅读器机制所导致的。

有趣的是，最近在哺乳动物细胞中的一项研究揭示了m6A与YTH结构域阅读器一起在增强mRNA的相分离潜力中的作用，从而影响mRNA在不同细胞环境下的稳定性和翻译[44]。因此，需要进一步研究以阐明m6A在影响植物mRNA稳定性中的直接或间接作用的具体机制。

m6A甲基化与哺乳动物的RNA成熟密切相关，这从其在可变剪接和多聚腺苷酸位点选择中的调节作用可以看出。例如，敲除小鼠中的METTL3会产生剪切异常的mRNA、外显子跳跃和内含子保留[45]，而FTO和m6A阅读器YTHDC1调节可变剪接[46,47]。令人惊讶的是，减少的m6A甲基化不会极大地影响选择性剪接，例如在水稻和拟南芥中，FIP37、VIR和OsFIP缺陷型突变体中mRNA剪接异常程度不高[12,13,17]。

然而，m6A阅读器CPSF30L通过其m6A结合活性[41-42]在全局水平上调节替代多聚腺苷酸化并控制多聚(A)位点选择。FIP37还与CPSF30L一起参与m6A辅助多聚腺苷酸化途径，以限制在重排基因组位点形成嵌合mRNA[40]。

此外，VIR依赖性m6A修饰的缺失会破坏mRNA3'端的形成，导致转向使用近端poly(A)位点[15]。这与在人类细胞中观察到的m6A甲基化减少导致远端多腺苷酸化向近端多聚腺苷酸化[48]的转变一致。在玉米中，与没有m6A修饰的基因相比，m6A修饰的转录本表现出与替代多聚腺苷酸化使用的显著相关性[49]，这表明m6A可能与poly(A)位点选择相关。m6A在控制替代多聚腺苷酸化中是否具有一般作用需要进一步探索。

m6A还改变RNA局部结构以影响RNA-蛋白质相互作用以及RNA加工和稳定性[28]。特别是m6A位点可以充当“m6A开关”，改变局部RNA结构以促进HNRNPC[28]的结合。在植物中，MTA介导的初级microRNA(pri-miRNA)上的m6A甲基化是miRNA的前体，可诱导pri-miRNA的二级结构[50]。m6A诱导的RNA二级结构，连同MTA和TOUGH之间的相互作用，促进了微过程复合蛋白（Microprocess complex）向pri-miRNA的募集，介导pri-miRNA向pre-miRNA和mature miRNA加工（图1e）。

相反，在盐胁迫下也揭示了m6A和RNA二级结构之间的相反相关性。盐胁迫下转录本上的m6A富集与RNA二级结构的减少相关，从而导致mRNA稳定性增加，从而导致蛋白质水平升高[51]（图1f）。

m6A在哺乳动物中通过多种机制促进翻译。METTL3招募翻译起始因子以直接增强包含m6A的mRNA子集的翻译，而与其甲基转移酶活性无关[52]。5'UTR内的m6A修饰也有不依赖经典5’ Cap的翻译机制[53]。尽管两项研究表明m6A阅读器YTHDF1和YTHDC2与m6A的结合提高了其目标的翻译效率[33,54]，但鉴于最近Jaffrey发表的一项研究认为YTHDF1在翻译中的作用仍然存在争议，一系列实验证明这三个YTHDF家族的旁系同源蛋白并不诱导翻译[55]，不过这个发表在Cell的研究立马在当年引起了m6A领域内诸多权威研究人员的争议。

在植物中，最近的研究揭示了m6A与转录本的翻译状态之间存在复杂的相关性，这取决于m6A水平以及核和细胞器转录本中的基因位置[49,56]。在玉米中，核转录本的翻译效率与其m6A水平呈负相关。然而，当m6A位点接近起始密码子时，这种相关性令人惊讶地逆转[49]。同样，m6A在体外抑制拟南芥和花椰菜线粒体RNA的翻译在多个位点携带m6A修饰，而翻译起始位点内的m6A修饰增强了线粒体转录物的体外可翻译性[56]。因此在植物中，m6A对翻译的机制影响，包括各种m6A组分在翻译中的具体作用，仍有待进一步探索。

m6A修饰在植物发育中的作用

干扰m6A writers、erasers或readers的表达已证明m6A在各种植物发育过程中的重要作用，例如胚、芽顶端分生组织、幼叶和根尖等m6A相关研究均有发表[11,13,37,38,57]。此外，多项研究揭示了m6A之间的相关性。对特定mRNA的修饰及其对植物生长的调节作用，从而提供将m6A与植物发育联系起来的机制见解。

m6A对于胚胎的正常发育至关重要，因为缺乏m6A writers蛋白复合物的核心蛋白如MTA、MTB、VIR和FIP37，会导致拟南芥种子发育的球状阶段胚胎停滞[11,12,57]（图1g）。同样，水稻Osmta2突变体也产生无法发育的种子[17]。由于对m6A介导的胚胎发育的靶点和机制知之甚少，因此处于不同发育阶段的胚胎中的具体m6A修饰A碱基位点将为了解m6A在胚胎发育中的作用提供见解。

胚后阶段FIP37缺失会导致顶端分生组织扩大，并在很大程度上破坏叶片发育[13]。FIP37介导的STM和WUS转录本上的m6A修饰加速了其降解，这对于平衡茎尖分生组织的增殖和分化至关重要。MTA介导的STM和WUS mRNA的m6A修饰同样是枝条分生组织发育所必需的[13]。其他writers，包括MTB和VIR，也可能参与调节枝条分生组织的发育，因为它们各自的突变体表现出发育迟缓等情况[12,58]。

虽然植物的hakai突变体没有表现出发育缺陷，但hakai和mta突变的组合导致比它们各自的单个突变体出现更严重的芽发育表型缺陷[12]，这意味着HAKAI可能与其他m6A writers（例如MTA就能调节芽分生组织的发育）协同作用。

总体而言，这些结果表明m6A修饰能够决定分生组织的命运（图1a）。同样在玉米中，愈伤组织（一组未分化的细胞）的诱导也受到m6A的影响。生长素极大地诱导m6A在参与早期愈伤组织诱导的转录本上富集，例如BABY BOOM和LBD转录因子，从而改善愈伤组织诱导[16]。

m6A修饰还控制毛状体和叶片的发育。缺乏MTA导致叶表皮上的毛状体分支增加，这意味着m6A对毛状体发育的影响[58]。ECT2与毛状体形态发生所需的几个转录本如TTG1、ITB1和DIS2等的3'UTR中的m6A位点结合，从而稳定它们的转录本调节毛状体分支[37](图1d)。

除了增加的毛状体分枝外，拟南芥ect2/3/4三重突变体还表现出出叶延迟（案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题）[38，59]。这一观察结果，连同过度表达ECT2[60]的植物表现出的小叶表型，意味着writers参与了叶片发育的控制。这种功能与这些阅读器的m6A结合能力有关，因为完整的m6A结合位点对于ECT2和ECT3在叶片形成中的体内功能是必不可少的[38]。然而，m6A潜在叶片发育的调控机制仍有待阐明。

除了在营养生长中的作用外，m6A还影响由特定m6A靶标介导的多个生殖发育过程。拟南芥中的m6A erasers如ALKBH10B直接能够去除FT、SPL3和SPL9上的m6A修饰，从而增强它们的mRNA稳定性以促进花过渡[27]（图1b）。

m6A阅读蛋白CPSF30L与过表达SOC1的3'UTR中的m6A位点结合，并控制SOC1多聚腺苷酸化位点的选择，从而产生相对稳定的SOC1转录本，其3'UTR较短，以促进花的转变[41]（图1b）。

水稻OsFIP将促进NTPase和苏氨酸蛋白酶基因的mRNA上m6A修饰增加，这些基因对孢子发生至关重要，从而下调这些转录物的积累以控制小孢子发生（水稻m6A甲基转移酶调控早期小孢子退化 | m6A专题）[17]（图1h）。SlALKBH2是番茄中的一种m6A eraser，可将SlDML2转录物去m6A甲基化并增加其稳定性以促进果实成熟（DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）[25]（图1c）。

m6A修饰还影响根的发育，在MTA、MTB、VIR或FIP37[12]表达受损的突变体中观察到有缺陷的根发育（图1e）。ect2/3/4三重突变体还表现出根系生长缓慢和有缺陷的方向性[59]。此外，PtrMTA在杨树中的过表达促进了根系发育[61]。尽管这些观察结果表明m6A对根系发育的巨大作用，但其潜在机制仍然未知。作为MTA缺乏会导致生长素信号传导所需的miR393b积累减少[50]，因此根发育缺陷可能是由于各种m6A writers突变体中的生长素反应受损所致。

m6A修饰在应激反应和胁迫中的作用

在拟南芥中，m6A writer突变体的转录组分析揭示了响应非生物和生物胁迫的基因表达的显著变化[14,58]。因此，m6A修饰被认为是长期盐胁迫响应和适应的重要调节机制也就不足为奇了[51]。此外，ECT2在正常生长条件下定位于细胞质，但在热或干旱胁迫下ECT2重新定位到应激颗粒(stress granules, SGs)中。由于SG包含48S起始前复合物和各种参与翻译的蛋白质，ECT2可能参与应激触发的翻译起始抑制[38,39]。

ECT1和ECT2还与CIPK1相互作用，在各种压力条件下介导钙信号传导[63]。值得注意的是，m6A参与非生物胁迫似乎在许多植物物种中很常见。南京农大侯喜林教授团队（联川生物m6A用户研究之一）发现，热应激下白菜大量mRNA m6A甲基化修饰有着显著变化，并与转录水平呈现很强的相关性[64]。在杨树中过表达PtrMTA后耐干旱胁迫能力更强[61]，而在小麦(Triticum aestivum)中，TaYTH基因在应对非生物胁迫（如热胁迫和磷饥饿）时表现出明显的表达变化[65]。

除了在非生物胁迫中的作用外，m6A还介导植物的生物胁迫反应。ALKBH9B突变后植物对病毒积累和全身侵袭产生负面影响，这与病毒RNA中m6A水平升高有关（病毒m6A专题 | 拟南芥去甲基化酶调控病毒上m6A修饰）[26]。病毒感染还会影响烟草中m6A甲基化转移酶或去甲基化酶基因的直系同源蛋白的表达，导致烟草中m6A水平降低[66]。尽管前面提到在理解m6A对植物对环境刺激和生物胁迫的反应的影响方面取得了进展（图1f），潜在机制需要进一步研究。

结束语

尽管m6A已被证明会影响植物发育过程和应激反应，但m6A如何在不同的发育环境或不同类型的细胞中特异性发挥其功能的潜在机制仍有待阐明。组蛋白修饰或转录因子是否可以作为染色质上的特定特征，并如同和动物及医学研究中那样，在组蛋白或转录因子影响下m6A修饰会动态影响植物中的RNA的m6A修饰水平，目前仍需进一步研究和探索[19,20]。

此外，单细胞/单分子测序技术的技术进步，如纳米孔RNA测序等技术允许以单碱基分辨率映射m6A位点[67,68]。不过Nanopore等三代纳米孔测序技术，目前在碱基假阳性识别上仍需人工智能算法等进行校正，所以当前大量研究仍然以抗体结合后二代测序技术检测m6A修饰信号为主。当然在单个细胞水平上检查m6A动态变化，看起来在未来是一个令人兴奋的机会方向。总之这些先进的实验方法应用，将允许检测单个细胞响应不同发育和环境信号的m6A动力学和变化的异质性，从而获得对涉及m6A的单细胞和多细胞水平。

由于m6A相关蛋白在各种植物物种中高度保守[69]，因此对具有重要经济意义的作物中的这些直系同源蛋白研究将揭示m6A在调节与作物发育和胁迫反应有关的重要农业性状中的作用机制。作物中m6A表观组测序，配合先进的DNA基因组编辑工具和新的RNA编辑技术[70,71,72]，包括使用催化失活的Cas13(dCas13)指导的m6A甲基转移酶进行靶向RNA修饰[70]，这些工具的整合将为植物育种开辟新的途径，通过赋予多种选择来设计目标转录物中特定腺苷的可编程甲基化。

参考文献：

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