微量m6A测序揭示m6A在神经发育、衰老及阿尔兹海默的作用 | m6A专题

论文标题：N6-methyladenosine dynamics in neurodevelopment and aging, and its potential role in Alzheimer’s disease

刊登日期：2021年01月

发表杂志：Genome Biology

影响因子：13.583

研究机构：美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院人类遗传学系

01
mRNA中m6A动态调节在神经发育中的主要作用

由于小鼠脑组织RNA起始量不够常规的m6A测序建库要求，加上作者需要4个大脑区域分别进行取样，在这种条件下只能采取微量m6A测序（low Input m6A-seq）（这篇何川教授作为编辑/审稿人的微量m6A测序方法学究竟有哪些玄机? | m6A专题）的方法，先对4个不同的大脑区域跨5个不同的发育时间点的B6小鼠进行测序。

生信分析结果表明大部分m6A peaks集中在3`UTR及CDS序列区间内（图1A）。此外，LC-MS/MS质谱检测也证实，在所有四种组织中，整体的m6A peak峰值呈现先下降后升高的趋势（图1B）。

作者进一步将关注点锁定到2周至6周龄小鼠，发现这两个时间点有着不同的差异m6A水平的mRNA，。在这些差异m6A的转录本中，m6A修饰对mRNA稳定水平的影响比在两个时间点的不同m6A水平的转录本影响更大。

此外作者还发现m6A与神经发育过程中的mRNA表达和mRNA剪接都有关（图1D、1E），这表明m6A是调节mRNA表达的关键，暗示着m6A修饰在神经发育中的主要作用。

02
差异m6A和基因表达分析解释发育过程中脑组织时间和空间特异性表达mRNA

为了了解m6A甲基化在小鼠大脑发育过程中的空间效应，作者进一步挖掘前面的微量m6A测序数据，详细关注了4个脑组织-小脑、下丘脑、海马和皮质的m6A甲基化修饰基因。

在2周和6周，作者观察到在小脑、下丘脑和海马区有强烈的组织特异性m6A甲基化倾向，但在大脑皮层没有，且发现这些m6A修饰转录本中有很大一部分参与了发育和转录调控途径。

更引人注目的是，下丘脑特异性m6A甲基化修饰发生在参与下丘脑发育的基因中。6周时，在小脑中与神经系统发育和神经发生相关的基因中出现了组织特异性m6A甲基化修饰信号。在下丘脑，GO富集分析表明这些基因与系统发育和金属离子运输相关，而细胞通信和信号传导事故海马区很重要的一块功能（图2）。

03 衰老过程中差异m6A甲基化基因与蛋白质修饰过程的调节、转录和神经元投射相关

随后，作者进一步从微量m6A测序数据中，比较了6周龄和52周龄小鼠大脑皮质的m6A差异，并对青春期和老年人死后人脑组织区域BA9进行m6A测序及转录组测序分析，并发现从青春期到老年，m6A甲基化水平显著增加。

此外，作者在人类和小鼠中都发现了大量m6A甲基化的基因，这表明m6A在衰老过程中具有高度的保守性和重要作用。GO分析表明，这些差异标记的基因参与了蛋白质修饰过程、转录和神经元投射等过程的调节（图3）。

04
m6A可以利用不同类型的UTR来调节与衰老相关的过程

m6A测序结果显示m6A修饰位点主要集中在3‘UTR区域，而且这些基因均参与调节细胞衰老。作者发现52周龄的小鼠与6周龄的小鼠相比，mRNA的polyA向远端非编码区转移（图4A）。

接下来作者发现40%的差异甲基化的m6A位点位于aUTR内。例如，参与蛋白质代谢途径的Uba3在52周龄的小鼠中的表达形式呈现出强烈的aUTR模式，并在那个区域存在m6A修饰。相比之下，6周龄的小鼠没有表现出相应的m6A甲基化修饰模式，52周龄的小鼠与6周的小鼠相比，Uba3 mRNA的表达显著下调，在aUTR中显示m6A甲基化的转录本在52周的mRNA表达明显低于6周。在其aUTR中含有m6A的基因参与了蛋白质的新陈代谢、蛋白质修饰、压力和自噬途径，这些过程被认为与衰老过程有关。

05
m6A修饰的降低与AD相关的通路中强烈相关的蛋白水平的降低有关

为了探索m6A是否在神经退行性疾病中发挥作用，作者同样与前面一样进行微量m6A测序，比较了在6月龄的家族性阿尔茨海默病小鼠(5XFAD)和年龄匹配的野生型(WT)对照组小鼠中差异m6A甲基化组的特征。

在WT和5XFAD小鼠中分别检测到8,264个和7490个m6A peak。与5XFAD相比，WT在3’UTR位点的m6A修饰显著富集。LC-MS/MS质谱实验也证实，与5XFA相比，WT Poly(A)+RNA中的m6A增加。

RNA-Seq数据和蛋白质组数据中发现5XFAD小鼠的FTO和METTL3水平分别比WT小鼠增加了8%和下降了4%。差异分析表明与WT相比，5XFAD小鼠中有120个转录本在3’UTR区域m6A甲基化修饰水平较低。GO分析表明，这些差异m6A甲基化基因参与了阿尔茨海默氏症进展过程中可能受到影响的生物过程，例如突触传递、离子转运调节和轴突颤动。反应体通路丰富了神经系统、神经递质受体、突触后信号传递和突触上的蛋白质-蛋白质相互作用。

差异m6A甲基化的转录本分析显示，5XFAD小鼠和WT小鼠之间的基因表达量没有任何变化，这表明m6A 不是这些转录本中mRNA水平的主要调节因子。

蛋白质组分析显示，不同基因mRNA上的m6A水平与蛋白质水平之间存在关联。与WT小鼠相比，5XFAD小鼠中许多差异表达的转录本与蛋白质表达降低相关。特别是在5XFAD中，与WT相比，许多低表达的蛋白质在其转录本上m6A甲基化水平显著不同，这表明m6A在5XFAD的蛋白水平调节中起着重要作用。

通过对四个靶基因进行RT-qPCR和WB证实了这些发现。例如，作者发现到同源蛋白MEIS2的3’ UTR区域中m6A甲基化减少，这与5XFAD小鼠中蛋白质水平的降低有关，但mRNA水平没有显著变化。MEIS2的缺失已被证明会导致运动发育延迟和学习障碍，提示m6A调节可能是预防AD表型的重要机制。

06
m6A通路调节与阿尔茨海默病相关的神经元毒性

作者进一步研究了m6A修饰对Tau毒性的影响。将METTL3、METTL14和YTHDF蛋白家族的RNAi果蝇的同源基因与AD Fly进行了杂交。我们发现，与对照相比，这三个品系的眼部表型都增强了，表明m6A的缺失增强了Tau的毒性。然后，作者进行了攀爬行为测试，观察到与Tau果蝇杂交的每个RNAi系的后代与Tau果蝇杂交的后代显示出比Tau对照更长的攀登时间，这表明前者由于失去METTL3、METTL14或YTHDF而有更严重的运动缺陷，表明m6A在AD发病机制中起着重要的调节作用。

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