微量m6A测序揭开癌症端粒稳态及基因组稳定性的秘密 | m6A专题

论文标题：Regulation of telomere homeostasis and genomic stability in  cancer by N⁶-adenosine methylation (m⁶A)

刊登日期：2021年4月

发表杂志：Science Advances

影响因子：14.136

研究机构：德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心Kexin Xu课题组

概要

m⁶A修饰在癌症发展中的作用被大量已发表的文献证实（珍藏版综述：肿瘤mRNA和非编码RNA的m⁶A修饰 | m⁶A专题），但其潜在机制尚不明确。本文作者发现了带m⁶A修饰的mRNA--HMBOX1。HMBOX1在恶性癌细胞中m⁶A修饰程度较高并被加速降解。所以高水平的m⁶A修饰导致介导的HMBOX1下调，最终导致端粒功能异常和p53信号失活，从而使得染色体异常并产生侵袭表型。

基于CRISPR的m⁶A编辑工具进一步证明，HMBOX1上的m⁶A修饰有助于诱导癌症的DNA层面上的基因组发生改变。尽管在多种癌症中，METTL3的表达与端粒长度呈负相关，与癌症基因组改变比例呈正相关，而HMBOX1 mRNA表达模式却与之相反。本研究表明，通过修正特定的转录组表观修饰水平，或可修复癌症基因组改变带来的影响。

01m6A整体水平和METTL3表达在多种癌症中均上调 

图1A-F 

m⁶A修饰主要由甲基转移酶METTL3催化，作者首先检测了几种癌细胞和正常配对细胞中去核糖体RNA（ribosomal removal RNA）的的m⁶A整体修饰水平 (图1A)。与正常细胞相比，癌细胞中m⁶A整体水平显著升高。同时METTL3也呈现出类似的表达模式，即METTL3在癌细胞中表达水平显著上升(图1B)。

为了证实在细胞系中观察到的结果，作者收集了12对原发性前列腺癌患者的肿瘤和癌旁组织，检测其m⁶A整体水平(图1C)和METTL3表达情况(图1D)。与癌旁相比，m⁶A修饰水平和METTL3表达水平在前列腺癌组织中显著升高。

此外TCGA数据表明，其他类型癌症如肝癌和肺癌中，也存在类似的现象。作者还通过对包含82对前列腺肿瘤和癌旁组织的进行组织芯片/免疫组化检测(图1E)，发现肿瘤样本METTL3阳性程度明显增高(图1F)。这表明在多种癌症中， METTL3表达及m⁶A整体修饰水平存在异常上调。

02METTL3的甲基转移酶活性对癌细胞的恶性表型至关重要

图1G-M

作者为证实METTL3的促癌作用，首先使用METTL3 shRNA构建前列腺癌细胞系（LNCaP）、肝癌细胞系（Huh-7）和肺腺癌细胞系（A549）稳转株并敲低METTL3。METTL3下调显著抑制所有癌细胞的增殖。

作者将LNCaP细胞中的内源性METTL3替换为野生型或METTL3催化功能丧失的突变体蛋白(图1G)。METTL3沉默后m⁶A整体水平降低，而重新加入野生型METTL3则补救（rescue）恢复了原有的表型结果(图1H)，且如细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型(图1I-L)也得以恢复。

作者继续在裸鼠体内建立了移植瘤模型，过表达野生型METTL3，可以抵消METTL3敲低对异种移植瘤生长的抑制作用(图1M)。这些结果证实，METTL3对于促进癌细胞恶性表型发挥重要作用，且这一作用依赖于其甲基转移酶活性。

03HMBOX1是癌细胞中m6A修饰的靶点 

图2A-J

作者对永生化的良性前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌细胞LNCaP进行了微量m⁶A测序（这篇何川教授作为编辑/审稿人的微量m⁶A测序方法学究竟有哪些玄机? | m⁶A专题）。作者将两个细胞系中的m⁶A修饰位点分为三类(图2A):“LNCaP”和“RWPE-1”分别代表在各自的LNCaP和RWPE-1中m⁶A强度更高的位点（也可理解样本特异性m⁶A位点/基因），而“common”组则包含这在两种细胞中强度相当的m⁶A位点（也可理解为共有的m⁶A位点/基因）。

接下来作者利用RNA-seq得到了一个METTL3敲低的差异基因列表(图2B)。然后将RNA-seq中确定的METTL3相关基因与微量m⁶A测序中的基因取交集（3篇10分客户文章教你m⁶A和RIP数据该如何挖掘 | RIP专题），得到323个共有的差异基因作为癌症中的潜在靶基因(图2C)并最终锁定HMBOX1。

METTL3敲低后，重新加入野生型METTL3和失活突变体对HMBOX1的表达产生了截然相反的影响(图2D)。

HMBOX1(又名HOT1)是一种直接且特异性结合双链端粒DNA的蛋白，，能够维持端粒酶-染色质结合和端粒长度。微量m⁶A测序数据表明，LNCaP中HMBOX1的3‘UTR处m⁶A信号显著高于RWPE-1(图2E)。在LNCaP、Huh-7或A549细胞中沉默或干扰METTL3时，使用m⁶A抗体进行IP验证时发现HMBOX1被富集程度显著减少(图2F)。此外，另外两种癌细胞Huh-7(图2G)和A549(图2H)敲除METTL3后HMBOX1显著上调。移植瘤模型进一步证实了该结果（图2I-J)。

这些结果表明m⁶A修饰的HMBOX1是多种癌症中的真正靶点，当m⁶A修饰水平上升时mRNA表达水平下调。

04
结果：m6A修饰促进了HMBOX1 mRNA的降解

 图3A-I 

作者发现，在LNCaP细胞中敲低METTL3时，HMBOX1的mRNA水平明显升高，而pre-mRNA水平几乎没有变化(图3A)。而ALKBH5表达降低时，HMBOX1 mRNA表现出相反趋势。作者推测HMBOX1上的m⁶A修饰可以使该mRNA发生降解。作者使用转录抑制剂放线菌素D处理LNCaP细胞检测HMBOX1的mRNA半衰期后发现，METTL3敲低显著增加了HMBOX1的稳定性(图3B)，而ALKBH5敲低则导致加速HMBOX1的降解(图3C)。

当作者敲低YTHDF2时，HMBOX1的mRNA和蛋白水平均上调(图3D)，而敲低YTHDC2对HMBOX1表达的影响很小。此外，当YTHDF2完全不表达时，即便是野生型METTL3无法再抑制HMBOX1表达(图3E)。

这些结果说明，m⁶A修饰是导致癌细胞中HMBOX1转录本降解的关键因素。

05
结果：癌细胞中METTL3介导的HMBOX1降解导致端粒功能障碍
 

图4A-G

 HMBOX1已被证实在多种肿瘤细胞中调节端粒长度，其下调会导致端粒磨损。因此作者建立了只过表达METTL3或同时过表达METTL3和HMBOX1的LNCaP和A549稳转株细胞，通过qPCR测定了传代早期（3-5代）和传代晚期(>30代)细胞的平均端粒长度，发现过表达METTL3细胞的端粒明显变短(图4A-B)。而同时过表达HMBOX1可减轻METTL3对端粒长度维持的抑制作用。

最后作者检测了TERT和TPP1之间的相作。TPP1作为端粒蛋白复合体的关键成分，直接与TERT结合，并招募端粒酶核糖核蛋白复合物。敲低HMBOX1时，TPP1和TERT之间相作被破坏，证实HMBOX1在TPP1协助端粒酶招募中的重要作用(图4E)。在pulldown实验中，METTL3过表达细胞的免疫沉淀中TERT表达水平显著下降，而重新加入HMBOX1可恢复TERT水平(图4F)。

FISH与免疫荧光染色证实过表达METTL3可显著降低TERC和TRF2共定位的细胞百分比，重新加入HMBOX1则逆转这一情况。

这些数据证实，肿瘤中METTL3的上调通过抑制端粒酶募集到端粒而导致端粒缩短，从而使癌细胞容易发生致瘤性基因组不稳定性，驱动恶性肿瘤的发生发展。

 图4H-L

 端粒过短最终会导致染色体末端的DNA损伤反应，这些端粒相关的DNA损伤信号被称为端粒功能障碍诱导灶(TIF)。作者在A549细胞中检测DNA断裂标记H2AX和端粒DNA(图4K)。发现仅过表达METTL3的晚期传代细胞显示出很强的H2AX信号，且与端粒FISH信号重叠。而这种共定位在对照细胞或共表达METTL3和HMBOX1的细胞中未被观察到。荧光信号定量结果证实，TIFs是在过表达METTL3的细胞中形成的，重新加入HMBOX1后，TIFs明显消失(图4L)。

这些结果证实，METTL3-HMBOX1轴抑制癌细胞端粒酶的募集,使得端粒长度过短，从而导致DNA损伤反应的发生。

06
结果6.过表达METTL3使HMBOX1甲基化，导致癌细胞p53通路失活并产生染色体不稳定性

 图5A-G

 端粒功能障碍引起的DNA损伤使基因组失去稳定性，或导致细胞癌变，或被DNA修复机制锁定，导致永久性细胞周期阻滞或细胞死亡。而这两种不同的结局取决于p53信号。

p53自身和p53的主要靶点p21都在METTL3过表达后显著降低，即使在H2AX显著增加的晚期传代细胞中也是如此。重新加入HMBOX1的补救实验则完全消除了METTL3对p53通路的抑制作用(图5A-B)。

然而，当作者检测TP53和CDKN1A（分别编码p53和p21）的mRNA水平时发现，只有CDKN1A表现出与蛋白质水平相同的变化，而TP53几乎没有变化。当细胞中过表达METTL3时，p53负调控因子MDM2水平显著上调，而加入HMBOX1后则恢复到基础水平(图5C)。

在已发表的CML的HMBOX1 ChIP-seq数据中，作者发现在MDM2转录起始位点下游5kb内有一个明显的peak。过表达METTL3时，HMBOX1募集到的MDM2启动子数量减少，将HMBOX1重新导入细胞后，募集的启动子数量又恢复了(图5D)。说明METTL3催化介导的HMBOX1的m⁶A修饰提升了MDM2的转录水平，最终导致p53信号通路失活。

 图5H-K 

在p53活性缺失的情况下，端粒磨损促进了复杂染色体重排，这可能会产生姐妹染色单体融合/交换、染色体末端融合、双中心染色体以及端粒序列的扩增或易位。于是作者又检测了过表达METTL3的癌细胞中，是否存在任何类型的端粒相关染色体畸变。

染色体定位(CO-FISH)结果显示，在高传代数的METTL3过表达细胞中观察到端粒姐妹染色体交换(T-SCE)显著增加(图5H)，加入HMBOX1后，这一现象减少了(图5I)。

这些结果说明，METTL3-HMBOX1 Axis是癌细胞基因组完整性的决定因素，而这种特异性表观转录修饰失调会导致染色体不稳定，从而促进肿瘤进展。

07
结果：METTL3诱导的基因组不稳定性使癌细胞向恶性发展，而HMBOX1可以缓解这一过程

 图6A-F

 METTL3过表达增强了LNCaP、Huh-7和A549细胞的促癌作用，并被HMBOX1的共同表达所抑制(图6A)。此外，METTL3过表达显著提高了LNCaP细胞的迁移(图6B)和侵袭能力(图6C)。

当HMBOX1再次导入细胞时，由METTL3过表达驱动的侵袭性表型被显著抑制。在另一个癌细胞系A549中也获得了类似的结果(图6,D和E)。说明HMBOX1对METTL3介导的癌症恶性进展具有抵抗作用。

同时，作者在基于dcas9的m⁶A编辑系统中测量细胞的增殖效率(图6F)。将sgHMBOX1注入表达野生型dcas9融合的ALKBH5的LNCaP细胞中，可以显著提高HMBOX1蛋白的水平，并抑制癌细胞的增殖。这一结果直接证明低m⁶A修饰水平的HMBOX1具有抑癌功能，而高m⁶A修饰水平的HMBOX1更容易被降解导致更强的促癌作用。

08
结果：METTL3-HMBOX1 Axis失调与端粒缩短及基因组不稳定性有关

 图7A-G 

HMBOX1具有抑癌作用，作者推测该基因在癌细胞中是否存在失调。在各种类型的肿瘤-正常细胞系(前列腺、肝和肺)配对组中，癌细胞中HMBOX1的表达持续减少。且TCGA数据集显示，HMBOX1在大多数癌症类型中显著下调(图7A)。所有这些数据表明，HMBOX1在人类癌症中异常下调。

接下来，作者对12对原发性前列腺肿瘤和正常癌旁组织进行检测发现，前列腺肿瘤中HMBOX1的m⁶A修饰水平更高(图7E)，mRNA水平更低(图7F)。在人肿瘤组织中，m⁶A peak丰度与METTL3的表达呈正相关，与HMBOX1的表达呈负相关(图7G)。

所有这些结果都证实HMBOX1的m⁶A甲基化程度整体较高，而这可能导致其在人类癌组织中表达下调。

 图7H-K 

最后作者确认了癌症患者组织中，METTL3-HMBOX1轴与端粒缩短和基因组不稳定性的关联。通过将前列腺肿瘤的端粒长度与METTL3或HMBOX1的表达联系起来(图7H)，发现HMBOX1与端粒长度呈正相关，符合其作为端粒酶活性和端粒稳态正向调节因子的结论。

同时，端粒长度与METTL3表达呈负相关。在TCGA数据集中，METTL3的mRNA水平与HMBOX1的表达呈负相关，但与基因组改变呈正相关 (图7I)。在肝癌(图7J)和肺癌(图7K)中，也可以不断观察到METTL3水平和癌症基因组异常的正相关关系。而HMBOX1在检测的所有癌症类型中总是与基因组改变呈负相关。

总之，METTL3催化的特定转录本(如HMBOX1)的m⁶A修饰对于促进基因组不稳定发挥了重要作用，而基因组不稳定是大多数癌细胞的共有特征。

小结

本文层层递进，首先利用癌细胞系进行机制探究，抽丝剥茧找到了m⁶A修饰的关键靶基因——HMBOX1,并在分子和蛋白水平，结合已发表文章的数据结果，对上下游靶点及相关作用机制进行了详尽阐述，最后在人体组织中进行了验证，证实了表观转录修饰对于基因组稳定以及癌症发生的重要意义。本研究厘清了METTL3-HMBOX1轴通过调节端粒长度，影响基因组稳定，进而调控癌症恶性表型的作用机制，但该机制能否转化为癌症治疗靶点仍需要更多的探索。

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