NC文章用微量m6A测序揭开滤泡辅助T细胞分化新机制 | m6A专题

Original 市场部-SLZ 联川生物 2024-03-27

论文标题：METTL3-dependent m6A modification programs T follicular helper cell differentiation

刊登日期：2021年02月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：14.919

研究机构：中国农业大学于舒洋组、中科院北京基因组研究所杨运桂组、第三军医大学叶丽林组

1. METTL3影响Tfh分化和免疫生发中心反应

作者将Mettl3-flox小鼠跟Cd4-Cre小鼠杂交后获得Mettl3^fl/fl Cd4-Cre小鼠，可以在T细胞中METTL3条件性缺失表达。使用LCMV-Armstrong病毒感染小鼠8天后，CD44⁺CXCR5⁺ T_FH细胞数量在Mettl3^fl/fl Cd4-Cre小鼠中显著降低。尽管T_h1细胞整体水平也随着Mettl3缺失而降低，但是METTL3缺失的CD4⁺T细胞显著倾向于向CD44⁺CXCR5^- T_H1细胞分化。

作者还发现 T_h1细胞表达的T-bet水平远高于T_FH细胞，METTL3缺陷型T_FH细胞上的CXCR5、PD-1、ICOS和Bcl-6的表达水平显着降低。

总之METTL3缺失严重损害T_FH细胞分化。

T_FH细胞参与B细胞分化过程中，LCMV-Armstrong病毒感染小鼠8天后GL-7⁺Fas⁺ GC B细胞、PNA⁺Fas⁺ GC B细胞、IgD^lowCD138⁺浆细胞以及LCMV特异性IgG均显著降低。

作者还使用了KLH免疫模型查看了其他辅助T细胞谱系分化后发现，GATA3⁺和IL-4生成细胞及Foxp3⁺细胞在Mettl3^fl/fl/Cd4-Cre小鼠中并未发生大的改变。这表明T_H1细胞和T_reg细胞分化不受METTL3影响。有趣的是，在METTL3缺陷小鼠中，产生RORγ⁺和IL-17a的细胞均显著减少，表明METTL3对蛋白质免疫后体内T_H17细胞分化至关重要。

2. METTL3对于TFH细胞早期激活分化至关重要

急性病毒感染期间，效应CD4⁺T细胞于T_FH细胞和T_H1细胞于免疫生发中心分化之前出现。作者将CTV标记的两种Naïve CD4⁺T细胞（分为Ctrl SMARTA CD4⁺T细胞和Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞）分别转移到对应的小鼠体内。病毒急性感染后，Ctrl SMARTA CD4⁺T细胞在病毒感染后表现出强烈增殖，并产生产生了大量的Bcl-6⁺ CXCR5⁺T_FH细胞。而Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞表现出延迟增殖，且Bcl-6⁺ CXCR5⁺T_FH细胞要显著低于Ctrl组。

此外，METTL3缺失导致CXCR5⁺细胞中的TCF-1表达也显着降低。Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA T_FH细胞中，Tcf7、Cxcr5、Bcl6、Pdcd1和Icos的表达量均降低。

以上结果均表明，METTL3对于病毒急性感染早期的T_FH细胞分化激活至关重要。

3. METTL3对TFH细胞转录组表达谱的影响

由于METTL3缺失影响CXCR5表达，由于SLAM在因此作者使用了CD44和SLAM，来识别激活态CD4⁺T细胞中的T_FH细胞和T_H1细胞。作者接下来从Mettl3^fl/fl Cd4-Cre小鼠和Ctrl小鼠中sort出了CD44⁺SLAM^hi^gh T_H1细胞和CD44⁺SLAM^lo^w T_FH细胞，进行转录组测序。功能富集分析表明，T_FH细胞上调的基因主要集中在T细胞和病毒防御功能，下调基因主要富集在T细胞增殖和分化功能上。

作者使用特定筛选出的T_FH细胞和GC中T_FH细胞的特定基因集进行GSEA分析后发现，大部分基因都在WT的T_FH细胞中富集，但是在METTL3缺失的T_FH细胞中并没有富集到。

当GSEA分析采用了T_h1、T_h2、T_h17和T_reg细胞的特征基因集时，作者发现所有这些基因居然都富集在METTL3缺失的T_FH细胞及T_h1细胞中。这些分析表明METTL3缺失导致T_FH细胞及T_h1细胞转录组基因表达的紊乱。

Th细胞中几个核心基因Tcf7、Cxcr5、Bcl6、Pdcd1和Icos均在METTL3缺失的T_FH细胞中低表达。GSEA分析表明，TCF-1激活基因集主要富集在WT的T_FH细胞中，而TCF-1抑制基因主要富集在METTL3缺陷的细胞中。同时LEF1的mRNA表达也是在METTL3缺失的T_FH细胞中显著降低。然而Bcl6和Gzmb的拮抗剂Prdm1，以及促凋亡调控因子Bcl2l11和Bax表达量则在METTL3缺失的T_FH细胞中表达更高。

这些结果表明，METTL3通过激活T_FH细胞但抑制T_h1细胞谱系相关基因来调节T_FH细胞分化程序。

4. METTL3以m6A催化活性依赖性方式促进TFH细胞分化

作者设计了METTL3-WT及METTL3-Mut（催化结构域突变）载体，然后这些METTL3蛋白在具有逆转录病毒转导系统的Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞中表达。急性病毒感染后，使用EV空载体转染的Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞，可使用METTL3-WT而不是METTL3-Mut进行补救，并促进分化为T_FH细胞。

此外，METTL3-WT的强制表达可恢复Mettl3^fl/fl Cd4-Cre T_FH和T_h1的细胞数量，且Tcf7、Cxcr5、Bcl6、Pdcd1和Icos表达均有表达上升和恢复。总之，METTL3的m⁶A催化活性是T_FH细胞分化的关键因素。

5. Tcf在3’UTR上的m6A修饰调控其mRNA稳定性

由于特定的T细胞sort之后量不多，RNA得率也较低，常规需要20-30μg total RNA不能满足m6A测序的最低起始量。于是作者对Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞及Ctrl组进行微量m⁶A测序及生信分析。GO富集分析表明差异m⁶A的基因大部分与病毒防御、T细胞活化和分化相关。前面提到的几个关键的候选基因中，只有Tcf的mRNA在3’URTR有明显的peak信号，且METTL3的RIP-qPCR也从另一面做了证实。

由于m⁶A修饰的mRNA下游功能和诸多不同的reader蛋白相关，涉及可变剪切、蛋白翻译及mRNA稳定性等。放线菌素D实验证实，Tcf在METTL3缺失的T细胞中表现出显著下降趋势。

综上所述， METTL3通过催化Tcf7在3' UTR处的m⁶A修饰增强其mRNA稳定性，以确保TCF-1表达并促进T_FH细胞的分化。

6. TCF-1强制表达在METTL3缺陷小鼠中恢复了TFH细胞的分化

作者使用TCF-1过表达体系利用逆转录病毒转染到SMARTA CD4⁺T细胞中，病毒转染第8天后发现METTL3缺陷的SMARTA CD4⁺T细胞中TCF-1表达显著增加。

作者接下来分析SMARTA CD4⁺T细胞中的T_FH细胞亚群中发现，Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞中表现出明显的CD44⁺ CXCR5⁺ T_FH细胞分化缺陷。但是TCF-1过表达可补救Mettl3^fl/fl Cd4-Cre SMARTA CD4⁺T细胞分化为T_FH细胞的能力。

此外，TCF-1过表达增加了Mettl3^fl/fl Cd4-Cre T_FH细胞的数量，但是不增加T_h1的细胞数量。同样PD-1^high CXCR5⁺ GC T_FH细胞也可以通过TCF-1过表达来补救。同时，TCF-1的强制表达可以在很大程度上恢复Mettl3^fl/fl Cd4-Cre T_FH细胞上TCF-1、CXCR5、PD-1、ICOS 和 Bcl-6 的表达水平。