CTM：单细胞测序首次揭示人类胆囊癌进展的多样性和肿瘤内异质性

论文标题：Diversity and intratumoral heterogeneity in human gallbladder cancer progression revealed by single-cell RNA sequencing

刊登日期：2021-06-25

发表期刊：Clinical and Translational Medicine

影响因子：8.554

研究机构：癌基因及相关基因国家重点实验室

文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8236117/

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前言

胆囊癌是一种早期无症状、起病隐匿、恶性程度高、侵袭性强的恶性肿瘤，以细胞高度异质性和预后差为特征，发病率低但死亡率高，患者5年生存率不到5%。目前治疗手段以化疗、靶向治疗和免疫疗法为主，但效果有限。

前期基于二代测序、微阵列等研究手段确定了可能导致胆囊癌发生和进展的信号通路中热点突变或异常表达的基因，但这对于临床靶向治疗的改善有限。且大多数研究均基于整体癌组织，未确定癌组织中的细胞异质性，以及免疫微环境不同所带来的影响。

研究团队首次利用单细胞测序技术对原发性、淋巴结转移性肿瘤组织以及邻近正常胆管组织的肿瘤细胞异质性，对不同类型胆囊癌的免疫微环境进行研究，探究胆囊癌发展和进展机制，进一步为胆囊癌提供新的治疗策略。

结果

1、不同类型胆囊癌之间存在肿瘤和TME异质性

该研究共5名患者包括3位胆囊腺癌患者、1位胆囊腺鳞状细胞癌患者，1位胆囊神经内分泌肿瘤患者。作者利用单细胞全转录测序技术共捕获了24887个细胞，包括原发肿瘤组织（9040个细胞），淋巴结转移瘤组织（8917个细胞），邻近正常组织（6930个细胞）。通过tSNE细胞聚类和Marker基于鉴定，共鉴定出10种细胞类型（下图B、C）。这10种细胞类型在不同的胆囊癌组织中分布不均，差异较为显著；在上皮胆囊癌和正常组织中，免疫细胞较为丰富，主要有T&NK细胞、B细胞和髓系细胞，但这些细胞在神经内分泌肿瘤组织中比例都较低（下图D）。以上结果揭示了不同类型胆囊癌之间的肿瘤和 TME 异质性。

2、胆囊上皮肿瘤细胞和神经内分泌肿瘤细胞的异质性

作者通过比较肿瘤组织中上皮细胞与其他细胞的CNV评分，上皮细胞显示出更高的CNV评分，证实了肿瘤组织中上皮细胞的基因组变异和恶性程度。而NET细胞CNV评分未显著升高，表明可能是其他基因组变异在 NET 细胞的恶性发展和转化中起重要作用（下图E）。 

作者整合EPCAM+上皮细胞和NET细胞进行分析，通过各自的Marker基因确定了3种细胞类型（下图A、B、C）。GSEA富集分析进一步揭示了这些上皮细胞的异质性：NET细胞在增殖、DNA合成、嘌呤生物合成方面表现出高活性，腺细胞表现出更强的胆酸代谢、胆固醇代谢和蛋白质分泌活性，而鳞状细胞在这些方面表现相对较弱（下图D）。

作者对胆囊腺癌和腺鳞状细胞癌进行拟时序分析发现原发组织、淋巴结转移组织和邻近正常组织中存在五种不同上皮状态（下图E）。五种细胞状态之间标志基因集的竞争性GSEA结果显示：状态1和2中胆汁酸代谢和蛋白质分泌活动较为丰富，状态3中减少了炎症相关活动，状态5中增加了血管生成和转移过程（下图G）。

作者发现来源于腺鳞状细胞癌的上皮细胞（患者SC133），细胞中富含状态3、4和5，覆盖腺和鳞状上皮肿瘤细胞（下图F）。为了推断这两种细胞类型之间的关系，作者分析了患者SC133的肿瘤细胞轨迹，拟时序结果显示腺癌具有向鳞癌分化的潜能（下图A），生物学过程包括表皮发育增加、角质化、角化活动等（下图B）。

作者还对原发性和转移性NET细胞（患者SC128）进行了拟时序分析，确定了五种细胞状态，在原发性和淋巴结转移性肿瘤中表现出不同的比例（下图C）。状态1细胞中胆汁酸相关代谢和炎症活性升高，而状态2显示细胞增殖增强和细胞连接下调过程，状态3、4和5细胞显示出上调的氧化相关过程（下图E、F、G）。以上结果表明在 NET 细胞的淋巴结扩散过程中，氧化相关活性增强。

以上这些结果证明了胆囊癌中恶性细胞的异质性和胆囊癌进展过程中的动态细胞状态转变。

3、胆囊癌组织中免疫微环境的改变

作者将T&NK细胞再分群后注释为六个细胞亚群（下图A、B），并将肿瘤和正常组织中的T&NK细胞进行比较：与邻近正常组织相比，原发性和淋巴结转移性肿瘤中 CD4+ Th和CD4+ T-reg细胞的比例增加，而浸润的CD8+ T细胞水平较低（下图E），代表免疫抑制性 TME。为了验证scRNA-seq结果，作者通过免疫组化染色分析了胆囊腺癌和邻近正常组织，并发现肿瘤中FOXP3+或CD4+ T细胞显著增加，CD8A+ T细胞减少（下图F）。同时，作者对来源于公共数据集中10对胆囊癌和正常组织，进行免疫浸润分析，发现CD8+ T细胞浸润和细胞毒性的得分较低，进一步证实了scRNA-seq结果。

此外，作者对B细胞再分群分析后发现滤泡B细胞在胆囊组织中具有潜在的抗原呈递作用（HLA-DRA、HLA-DPB1等）（下图H、I）。GrB+ B细胞可以分泌细胞毒性蛋白酶颗粒酶 B。与T&NK细胞类似，NET组织中很少检测到B细胞（下图K），进一步表明NET组织免疫浸润表型较差。

4、胆囊癌组织中巨噬细胞由促炎向抗炎转变

作者将髓系细胞鉴定为四种细胞类型，并根据marker基因将巨噬细胞进一步注释为四个不同的细胞亚群，包括CCL20^hi/CD163^lo巨噬细胞、CCL20^lo/CD163^hi巨噬细胞、APOE+巨噬细胞和I型干扰素激活巨噬细胞（下图A、B）。CCL20^hi/CD163^lo巨噬细胞显示促炎细胞因子的高表达和M2巨噬细胞标记物的低表达，而CCL20^lo/CD163^hi和APOE+巨噬细胞的表达模式相反，APOE+巨噬细胞也高度表达抗炎标记物（下图C）。

作者对所有巨噬细胞进行无监督轨迹分析，结果显示胆囊癌中巨噬细胞从CCL20^hi/CD163^lo、CCL20^lo/CD163^hi和TypeI-IFN巨噬细胞向APOE+巨噬细胞的连续状态转换（下图E）。作者通过GO富集分析发现，包括对IFN-γ的反应、淋巴细胞活化的阳性调节和淋巴细胞分化在内的过程增加，而白细胞趋化性、细胞趋化、IL-6产生等减少（下图F）。

5、基质细胞和内皮细胞的重塑与胆囊癌的血管生成密切相关

作者将成纤维细胞再分群，得到三种细胞类型：RGS5+、PSOTN+ 和 PDGFRA+ 成纤维细胞（下图A）。PDGFRA+成纤维细胞表现为成纤维细胞标志物的高表达、补体和凝血级联反应以及矿物质吸收的显著增强，表明它们在胆囊组织止血中的作用；PSOTN+成纤维细胞外基质基因表达较高（POSTN、TAGLN、FN1等基因），KEGG富集结果显示高蛋白质消化和吸收活性，表明这些细胞可能有助于胆囊癌中的细胞外基质降解和微环境重塑；RGS5+ 成纤维细胞表达与血管生成相关的基因（下图B、C）。与邻近正常组织相比，PDGFRA+ 成纤维细胞在原发性和淋巴结转移性肿瘤中显著降低，而PSOTN+和RGS5+细胞显着增加，反映了肿瘤组织中细胞外基质的一般重塑（下图D）。

同样，内皮细胞再分群得到两个细胞亚群KDR+内皮细胞和ACKR1+内皮细胞（下图E）。KDR+ ECs中血管生成因子VEGFA 和 VEGFB 的受体高表达，表明其参与了胆囊组织中的血管生成；ACKR1+ ECs则表现出与趋化因子相关基因的表达，可能调节胆囊组织中的 T 细胞分化（下图F、G），且其在上皮胆囊癌组织中有轻微增加（下图H）。

上述结果表明，基质细胞和内皮重塑可能增强胆囊癌中的血管生成。

6、肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间存在显著相互作用

作者为了阐明胆囊癌中不同细胞亚群与邻居正常组织间的相互作用，利用CellPhoneDB算法构建细胞网络（下图A、B、C）。其中，抗炎巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞之间的配体-受体相互作用最为显著，其次是抗炎巨噬细胞和肿瘤和正常组织中的肿瘤细胞/内皮细胞。而与抗炎巨噬细胞不同，促炎巨噬细胞与上述细胞类型的通讯较弱。在原发性肿瘤组织中，肿瘤细胞和ACKR1+内皮细胞之间的相互作用增强（CXCL1/ACKR1和CXCL8/ACKR1之间）。与腺癌相比，鳞状细胞癌通过MIF/TNFRSF10D、EGFR/GRN、EGFR/HBEGF和EPHB2/EFNB2 相互作用显示出与内皮细胞的强通讯（下图B、D）。对于巨噬细胞-上皮相互作用，作者发现ACKR+ ECs与原发性和淋巴结转移组织中的抗炎巨噬细胞之间的相互作用显著增加，通过ACKR1+ ECs中的LGALS9及其巨噬细胞中的受体（CD44、SORT1、HAVCR2 和 LRP1）（下图E），这可能有助于胆囊癌中巨噬细胞的募集和状态转变。

总结

该研究首次描述了原发性胆囊肿瘤、淋巴结转移瘤和邻近正常胆囊组织的单细胞转录组学特征，以揭示胆囊癌肿瘤异质性和TME亚组分的分布。

阐述了胆囊腺癌、腺鳞癌和NET的特点及其差异。腺癌细胞失去了抗原呈递MHC II分子，可以转分化为鳞状肿瘤细胞。上皮细胞胆囊癌中的免疫抑制性TME包括浸润性CD4+T-reg、CCL20^lo/CD163^hi和APOE+巨噬细胞，但它们是NET的免疫沙漠表型。胆囊癌组织中的基质细胞和内皮细胞重塑，促进血管生成和淋巴管生成，以维持胆囊癌的生长和转移。

以上是胆囊癌组织的单细胞转录组分析结果，加深了对胆囊癌发展和进展机制的理解，并为胆囊癌未来的治疗靶点提供了新的、深刻的见解。

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