高手是怎么用宏基因组测序的？ | 微生物专题
说到微生物组研究，肠道菌群检测，大家首先想到的就是扩增子测序，比如16S测序。16S测序因其高性价比，简单易懂的数据结果，成为上手微生物组研究的入门工具。
而研究微生物组的另一个工具——宏基因组测序，却常被大家忽视。究其原因，一方面可能是其价格略高（价格和价值是匹配的），另一方面是大家觉得做16S测序就挺好，像是没必要去做宏基因组测序。真的是这样吗？
近期Cell上的微生物组文章再次强调使用高分辨率的宏基因组测序开展微生物组研究的必要性，因为其不仅有到种（species）水平的更高的物种分辨率，而且还能提供菌群的基因功能信息，这将有利于全面精细地解析菌群的物种组成，并基于菌群携带的基因信息来阐释菌群发挥的功能（Yap et al. Cell (2021)）。
因而宏基因组测序不仅能鉴定样本中细菌群落的物种组成，还能检测其他微生物群落的组成。也是因为宏基因组测序是对菌群的全部基因进行测序，使用信息量更丰富的基因数据库（如NR库）进行菌群的物种鉴定，使得其具有更高的物种分辨率，可以鉴定到种水平甚至部分到株（strain）水平。
不仅如此，通过宏基因组测序获取的菌群基因信息，可以进一步分析这些基因的功能和参与的代谢通路，乃至探讨菌群与宿主的相互作用关系。上述优势都是扩增子测序不具备的。两种微生物组检测技术的比较见表1。
图1 宏基因组测序
宏基因组建库测序过程与常规基因组测序是一样，将提取的全部微生物的总DNA进行序列片段化，末端修复后加A，然后连接接头，最后PCR扩增文库并上机测序。测序采用主流的illumina NovaSeq6000 PE150模式进行。
表1 宏基因组测序与扩增子测序比较
通常地，如果你的研究目的是揭示微生物组如肠道菌群对宿主的作用机制，那么应该做宏基因组测序。
在需要精细鉴定与疾病或表型相关的核心菌（生物标志物）时，也应该优先选择宏基因组测序。
在实际使用中，宏基因组测序和扩增子测序也经常配合使用，各有侧重，用扩增子测序进行大规模样本的菌群多样性分析，再结合宏基因组测序对重要样本组中的菌群基因功能和通路进行深入解析，同时也能辅助更精细的物种鉴定。
从发表的微生物组文献看，影响因子较高（8分或10分以上）的文献采用宏基因组测序的居多，并且在相似的实验设计下，采用或增加宏基因组测序有明显的加分效果。
在了解了宏基因组测序是什么和能做什么后，我们以大家在研究中常遇到的四种场景为例，用具体的案例来说明怎样用好宏基因组测序，发挥出它的高价值，提升微生物组研究的档次。
场景一：样本数不够多，还能做微生物组研究吗
菌群组成在人群中的变化大，个体遗传和生理因素、健康状态、生活方式以及种族等都会引起菌群组成的变化。因此，开展微生物组研究时，样本数量的多少将直接决定结果的可信程度。
样本多少算足量呢，以临床相关的菌群研究为例，做扩增子测序样本数建议≥100例/组。然而，考虑到课题周期和样本采集速度，积攒到足够多的样本并不容易且时间不允许。当然也不希望因样本数少而降低发文档次。此时，选择宏基因组测序开展菌群研究，是个各方面都兼顾到的方案。目前宏基因组测序实验，建议样本数≥50例/组。
发表期刊：Fertil Steril
影响因子：7.329
发表时间：2020.6
研究目的：鉴定多囊卵巢综合征(PCOS)患者不同的肠道菌群种类，揭示肠道菌群失调与病理改变之间的可能关系。
研究分组：患多囊卵巢综合征的育龄妇女(14人)和对照组(14人)
研究样本：粪便
研究方法：宏基因组测序
研究导图：
入组标准：(1)20-35岁和(2)汉族。
排除标准：(1)高催乳素血症、甲状腺功能减退或甲亢，或肝、肾或心功能异常；(2)胃肠疾病、活动性感染、甲状腺功能障碍、高催乳素血症、高血压或糖尿病；(3)3个月内服用口服避孕药、糖皮质激素、抗雄激素药、促排卵药、糖尿病药物或其他类固醇药物；或(4)在研究前至少3个月内接受抗生素治疗。
研究发现：鉴定出PCOS相关的肠道菌株，并揭示其与PCOS临床指标的相关性。以下为部分结果图表展示。
图1 PCOS组与对照组差异微生物种类
图2 PCOS微生物组的功能特征和宏基因组物种与临床指标的关联分析
参考文献：Chu W, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020 Jun;113(6):1286-1298.e4.
发表期刊：JCI Insight
影响因子：8.315
发表时间：2021.10
研究目的：检查口腔菌群与长期COVID症状持续时间之间的关系
研究分组：早期症状缓解(13例)、持续症状(4例)和长期COVID(10例)
研究样本：舌咽拭子，治疗前采集
研究方法：宏基因组测序
研究导图：
研究发现：口腔菌群和长期COVID有关，揭示出口腔菌群功能障碍可能有助于持续的COVID症状。以下为部分结果图表展示。
图1 细菌丰度预测正在出现症状的COVID-19
图2 炎症相关的细菌代谢通路与持续出现症状的COVID-19显著相关
参考文献：Haran JP, et al. Inflammation-type dysbiosis of the oral microbiome associates with the duration of COVID-19 symptoms and long COVID. JCI Insight. 2021 Oct 22;6(20):e152346.
发表期刊：NPJ Biofilms Microbiomes
影响因子：7.290
发表时间：2020.11
研究目的：使用更高分辨率的宏基因组测序比较早产高危妇女和低风险对照组的阴道菌群组成和基因功能差异
研究分组：早产高危妇女（35例）和低风险对照组（14例）
研究样本：阴道拭子
研究方法：宏基因组测序
研究导图：
注：
risk_PTB：有早产风险且在怀孕37周前分娩的妇女
risk_FTB：有早产风险但足月分娩的妇女
non-risk_PTB：怀孕37周前分娩的低风险妇女
non-risk FTB：足月分娩的低风险妇女
入组标准：18岁以上且怀孕的妇女
排除标准：正在接受抗生素治疗的妇女
研究发现：鉴定出卷曲乳杆菌与足月妊娠密切相关，而其他微生物群落与早产相关。早产菌群的功能潜力不同于足月妊娠的菌群。以下为部分结果图表展示。
图1 不同分组的物种多样性
图2 不同分组的物种组成
参考文献：Feehily C, et al. Shotgun sequencing of the vaginal microbiome reveals both a species and functional potential signature of preterm birth. NPJ Biofilms Microbiomes. 2020 Nov 12;6(1):50.
02场景二：鉴定菌群组成的分辨率不够高怎么办？
采用16S测序，可以将菌群鉴定到属水平，再往下到种水平就不怎么能分辨出来了。尽管目前有全长16S测序，在鉴定菌群到种有一定改善，然而受数据库限制仍很难获取全面的菌种信息。
此时，采用宏基因组测序，可以获取更高的菌群分辨率，因为宏基因组测序是基于NR数据库，借助丰富的基因信息可以鉴定菌群到种水平，甚至部分到株水平，这将有助于找到具有更佳预测能力的菌群标志物。
发表期刊：ISME J.
影响因子：10.302
发表时间：2021.11
研究目的：探索格雷夫斯病（GD）患者在肠道菌群分类、基因、通路和功能、代谢产物和突变谱上的变化，并建立用于GD诊断的菌群标志物。
研究分组：重度Graves病患者（GD II，36例）vs 轻度Graves病患者（GD I，64例）vs 健康对照组（62例）
研究样本：粪便
研究方法：宏基因组测序 + 短链脂肪酸检测
研究导图：
研究发现：鉴定出包括菌种、MAG、基因和SNPs在内的生物标志物组合，其预测GD的能力优于任何单一生物标志物。以下为部分结果图表展示。
图1 GD患者肠道菌群及代谢产物的变化
图2 使用机器学习法鉴定出GD相关的生物标志物
参考文献：Zhu Q, et al. Compositional and genetic alterations in Graves' disease gut microbiome reveal specific diagnostic biomarkers. ISME J. 2021 Nov;15(11):3399-3411.
微生物组的研究，停留在16S测序数据的多样性分析是远远不够的。只有揭示菌群所发挥的功能，才能进一步解释菌群失调与疾病发生发展的关系乃至作用机制。
此时，使用宏基因组测序，可以进一步获取菌群携带的基因信息，分析菌群参与的功能和通路，将显著提升微生物组研究的深度。
发表期刊：Nat Commun.
影响因子：14.919
发表时间：2021.11
研究目的：探索肠道菌群对早发性结直肠癌（yCRC）患者的诊断价值
研究分组：yCRC vs 晚发性（oCRC） vs 对照，具体见流程图
研究样本：粪便
研究方法：16S测序（1038例） + 宏基因组测序（200例）
研究导图：
排除标准：有家族性结直肠癌病史、炎症相关结直肠癌病史、肠易激综合征（IBS）病史、与其他恶性肿瘤共存、在结肠镜检查或新辅助治疗前未进行粪便采样。
研究发现：发现yCRC和oCRC各自有关键富集的菌（属），并且通过宏基因组测序揭示yCRC有独特的细菌代谢功能特征；基于菌群标志物开发出了诊断模型。以下为部分结果图表展示。
图1 yCRC和oCRC粪便菌群的细菌多样性
图2 菌群标志物与常规筛查方法的预测性能比较
参考文献：Yang Y, et al. Dysbiosis of human gut microbiome in young-onset colorectal cancer. Nat Commun. 2021 Nov 19;12(1):6757.
微生物组的工作不仅是研究菌群自身，也需要关注菌群与宿主的互作。
菌群对宿主施加作用的主要方式是通过其产生的代谢物。因此，讲菌群与宿主互作的故事，应同时考虑菌群的组成和变化，以及菌群代谢物变化可能对宿主的影响，还应考查宿主血液代谢组的变化（可与菌群代谢组变化进行呼应）。
根据研究对象和目的的不同，有时也会联合考查宿主的转录组和蛋白质组的变化。
发表期刊：J Am Soc Nephrol.
影响因子：10.121
发表时间：2020.6
研究目的：探讨肠道菌群组成和功能与早发性草酸钙肾结石之间的关系
研究分组：肾结石患者(44例)和对照组(44例)
研究样本：粪便
研究方法：宏基因组测序 + 非靶向代谢组
研究导图：
研究发现：肠道菌群的缺失与代谢组扰动有关，代谢组可能是早发性草酸钙肾结石疾病的上游决定因素。以下为部分结果图表展示。
图1 在肾结石患者中，32个细菌分类群的相对丰度和细菌基因丁酰辅酶脱氢酶的丰度都较低
图2 肾结石患者的粪便代谢组是不同的
参考文献：Denburg MR, et al. Perturbations of the Gut Microbiome and Metabolome in Children with Calcium Oxalate Kidney Stone Disease. J Am Soc Nephrol. 2020 Jun;31(6):1358-1369.
发表期刊：Clin Gastroenterol Hepatol.
影响因子：11.382
发表时间：2021.3
研究目的：通过研究疲劳/非疲劳克罗恩病患者的粪便微生物组，血清代谢组和蛋白组的变化，探讨克罗病引起疲劳症状的机制。
研究分组：106例静止性克罗恩病患者，60例溃疡性结肠炎患者
研究样本：粪便、血清
研究方法：宏基因组测序 + 非靶向代谢组 + Olink微量蛋白质组（查看此项新技术）
研究导图：
研究发现：在对166名IBD患者的粪便菌群和血清代谢组与蛋白质组的分析中，发现血清代谢物和粪便微生物的改变与疲劳有关。以下为部分结果图表展示。
图1 静止期炎症性肠病患者间的微生物组种水平差异
图2 疲劳微生物组得分与疲劳定量负荷的相关性分析
参考文献：Borren NZ, et al. Alterations in Fecal Microbiomes and Serum Metabolomes of Fatigued Patients With Quiescent Inflammatory Bowel Diseases. Clin Gastroenterol Hepatol. 2021 Mar;19(3):519-527.e5.
发表期刊：PNAS
影响因子：11.205
发表时间：2020.9
研究目的：阐明不同时期的多发性硬化症（MS）肠道微生物组的微生物组成和功能差异。
研究分组：62例RRMS（复发缓解型MS），15例SPMS（继发进展型MS），21例不典型MS、20例NMOSD（视神经脊髓炎谱系障碍），以及55例健康人
研究样本：粪便
研究方法：16S测序 + 宏基因组测序 + 靶向代谢组（SCFA & 硫代谢组）
研究导图：
研究发现：不同的MS发展进程中肠道生态和功能微环境发生了显著变化，特别是RRMS中短链脂肪酸生物合成减少以及SPMS中氧化水平升高。以下为部分结果图表展示。
图1 不同组中肠道微生物组的alpha多样性分析
图2 RRMS和SPMS肠道微生物功能图谱的差异
参考文献：Takewaki D, et al. Alterations of the gut ecological and functional microenvironment in different stages of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Sep 8;117(36):22402-22412.
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