用户文章|Molecular Cell(IF=19)：mTORC1通过控制S-腺苷甲硫氨酸合成和m6A修饰促进细胞生长

论文标题：mTORC1 stimulates cell growth through SAM synthesis and m6A mRNA-dependent control of protein synthesis

刊登日期：2021年05月

发表杂志：Molecular Cell

影响因子： 19.328

技术手段：代谢组、m6A-seq、DNA甲基化测序

（一）研究背景

雷帕霉素靶蛋白(mTORC1)参与调控翻译后修饰和转录机制调节机体代谢和细胞生长对营养物质、生长和致癌信号产生反应。甲硫氨酸是人体所需的一种必需氨基酸，可在人体内分解和循环利用，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸的下游代谢产物，是细胞内最主要的甲基供体。研究甲硫氨酸循环与癌细胞的生长是研究癌症代谢领域的一个新兴的方向。

（二）研究内容

1. mTORC1信号传导刺激S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的合成

图1 mTORC1刺激SAM合成

为揭示mTORC1信号通路调控的新代谢途径，作者对HeLa细胞（对照组、胰岛素激活剂和mTORC1抑制剂处理）进行代谢组分析(图1A)。在鉴定出的200个代谢物中，与对照组相比胰岛素激活的HeLa细胞中37种代谢物的稳态水平显著升高，而雷帕霉素（mTORC1抑制剂）处理后31种代谢物显著降低(图1B-C)。mTORC1正向调控的5种主要代谢通路:嘧啶合成、嘌呤合成、葡萄糖代谢、精氨酸代谢、甲硫氨酸代谢通路(图1D)。

作者利用CRISPR/Cas9在HEK293E细胞中敲除TSC2（mTORC1抑制基因）验证mTORC1对精氨酸代谢和甲硫氨酸代谢通路的调节作用，敲除TSC2(ΔTSC2)的HEK293E细胞表现出不依赖生长因子的mTORC1信号激活。与野生型细胞相比，ΔTSC2 HEK293E和HeLa细胞中5-腺苷甲硫氨酸（SAM）的丰度增加，而雷帕霉素处理后SAM的丰度降低(图1E)。此外，敲除介导mTORC1信号通路中的必要成分—mTOR调节相关蛋白(RAPTOR)，降低了SAM的稳态水平，表明SAM稳态水平是由mTORC1特异性调控(图1F)。

为确定mTORC1信号是否调节SAM合成，作者使用同位素¹³C5标记蛋氨酸(图1G)，在ΔTSC2 HeLa细胞和胰岛素激活的细胞中发现环境中蛋氨酸消耗可以刺激mTORC1信号转导，从而刺激细胞合成SAM(图1H)。此外，使用¹³C5同位素示踪法也证实了在依赖mTORC1的黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和乳腺癌细胞系中调控SAM的合成(图1I和1J)。综上所述，mTORC1信号通路通过蛋氨酸的消耗刺激SAM的合成。

2.在mTORC1下游诱导甲硫氨酸腺苷转移酶2α（MAT2A）表达以维持SAM的合成

图2 mTORC1信号增加MAT2A的表达

为阐明依赖mTORC1的SAM产生的潜在机制，雷帕霉素处理抑制SAM合成表明mTORC1通过长时间周期调节该信号通路(图2A)。与野生型相比，SAM合成具有的特定酶和基本支持途径(丝氨酸/甘氨酸合成和单碳代谢)的转录本在ΔTSC2细胞中增加，且对雷帕霉素处理敏感(图2B-C)。在SAM合成的上游MAT2A（只有位于SAM合成上游的MAT2A蛋白丰度发生变化）也表现出类似的结果(图2D)。MAT2A有两种蛋白异构体(α2和α2’)，具有75.7%的同源性，MAT2A α2’是由α2通过拼接机制生成(图2E)。

在ΔTSC2的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人肾源性血管平滑肌脂肪瘤(AML)和HEK293E细胞中，mTORC1信号通路调控MAT2A表达水平（图2F-G）。在ΔTSC2 HeLa细胞中MAT2A活性较野生型细胞显著增加，在雷帕霉素处理后降低(图2H)。其他几种癌细胞系表现出通过依赖mTORC1的MAT2A蛋白水平上的调控(图2I)。以上结果表明，mTORC1有助于增加MAT2A的表达和活性，以刺激SAM的合成，表明MAT2A转录本和蛋白水平直接调控mTORC1信号通路下游SAM合成。

3.MAT2A受mTORC1-c-MYC信号轴的转录调控

图3 mTORC1-c-MYC信号轴控制MAT2A表达和SAM合成

为确定mTORC1调控MAT2A表达的转录机制，作者通过检测mTORC1下游的候选转录因子对MAT2A蛋白和转录水平的影响。敲除c-MYC降低了ΔTSC2 HeLa细胞中的MAT2A蛋白和mRNA水平(图3A-B)。化学抑制剂处理抑制c-MYC活性也降低了MAT2A蛋白和mRNA水平(图3C)。通过对癌细胞系百科全书(CCLE)数据库进行基因表达相关性分析揭示了MAT2A和c-MYC表达之间的很强的相关性。对人、小鼠和大鼠MAT2A内含子1的比对显示了c-MYC的两个高度保守、一致的DNA结合序列(图3D)；染色质免疫沉淀(ChIP)分析表明，在ΔTSC2细胞中，c-MYC与MAT2A内含子1结合，雷帕霉素处理后能阻断两者的结合反应(图3E)。c-MYC基因敲除或化学抑制能阻断mTORC1诱导的ΔTSC2细胞中SAM合成的增加(图3F)。此外，在不同来源的癌细胞系中c-MYC控制MAT2A蛋白水平，表明c-MYC介导癌细胞中SAM的合成(图3G-H)。综上所述，mTORC1通过c-MYC介导的转录机制控制MAT2A的表达和SAM的合成(图3I)。

4. mTORC1通过调控m6A刺激RNA甲基化

图4 mTORC1下游SAM动态增加导致m6A修饰

作者为探究依赖mTORC1的SAM合成对表观遗传修饰机制(如DNA和组蛋白甲基化)的影响，利用DNA甲基化测序分析基因组甲基化水平，与野生型相比ΔTSC2 HeLa细胞的整体DNA甲基化显著增加，利用雷帕霉素处理或直接抑制MAT2A 没有降低甲基化水平，表明DNA甲基化状态增加与mTORC1和MAT2A无关。

作者通过同位素标记的蛋氨酸（³H-CH3）评估mTORC1和MAT2A调控RNA甲基化(图4A)。ΔTSC2或胰岛素刺激能激活mTORC1反应导致同位素标记的总RNA显著增加，而雷帕霉素或MAT2Ai处理会降低这种效应，表明RNA在mTORC1下游甲基化(图4B-C)。胰岛素激活的HeLa细胞中RNA的m6A 丰度增加，mTORC1和MAT2A抑制后RNA的m6A丰度降低(图4E)。在雷帕霉素或MAT2A抑制剂处理的细胞中，超量的SAM (1 mM)部分恢复了m6A的丰度(图4F)，表明RNA甲基化修饰依赖于mTORC1和MAT2A的调控，且在一定程度上受SAM有效性调节。

为探究mTORC1信号调节m6A的影响，作者利用m6A-seq确定雷帕霉素处理的ΔTSC2细胞差异表达基因(图4H)，结果发现抑制mTORC1信号后，减少m6A相关的几种合成代谢过程的mRNA修饰，包括磷脂酰肌醇代谢，血管内皮生长因子（VEGF）信号传导，细胞周期转变等(图4I)。同时，也富集到参与细胞死亡机制的RNA甲基化修饰(图4I)。上述发现符合mTORC1信号的促生长和抗凋亡作用，进一步证实mTORC1信号下游发生m6A修饰。5.mTORC1增加甲基转移酶复合物(WTAP)丰度，介导m6A RNA依赖的蛋白合成和细胞增殖

图5 激活mTORC1可刺激WTAP蛋白丰度，从而控制m6A的RNA修饰水平、蛋白质合成和细胞增殖

为阐明mTORC1信号直接影响催化m6A的RNA修饰的分子机制。作者检测了m6A甲基转移酶复合体（WTAP-METTL3-METTL14）、调控因子RBM15和RBM15B及去甲基酶FTO和ALKBH5的蛋白质水平(图5A)。在ΔTSC2 HeLa细胞、AML TSC2细胞和癌细胞中，mTORC1激活后只有WTAP蛋白水平显著增加，在雷帕霉素处理后降低，表明mTORC1正调控着WTAP蛋白的丰度（图5B-C）。随后，为研究WTAP蛋白水平和转录水平是否与HeLa细胞中mTORC1信号的生理激活有关，发现胰岛素刺激一段时间内迅速增加了WTAP蛋白的丰度，而WTAP转录水平没有显著改变(图5D-E)。先前研究表明m6A修饰可能通过3' UTR甲基化促进帽依赖的mRNA翻译。METTL3是m6A甲基转移酶复合体的催化亚基，敲低METTL3导致ΔTSC2 HeLa细胞中蛋白质合成速率显著降低，而不改变mTORC1信号(图5F)，表明RNA的m6A需要在mTORC1信号下游支持蛋白质合成。由于WTAP蛋白的丰度由mTORC1信号正调控，检测敲除WTAP是否会损害生长因子诱导的蛋白合成，结果WTAP下调降低了基础蛋白合成速率(图5G)。此外，在ΔTSC2 HeLa细胞中敲除WTAP降低了蛋白质合成速率，而不改变mTORC1信号(图5H)。与合成代谢调控的结果一致，敲除WTAP降低了癌细胞株的增殖(图5I)。综上，WTAP的蛋白质丰度由mTORC1信号正调控，m6A是依赖mTORC1的蛋白质合成和细胞增殖所必需的。

5.mTORC1-c-MYC信号轴调节MAT2A表达，支持蛋白质合成和肿瘤生长

图6 mTORC1-MAT2A轴支持m6A上游蛋白质合成

为阐明依赖mTORC1的MAT2A表达参与mTORC1启动mRNA合成蛋白质的机制。作者通过抑制MAT2A发现在HeLa细胞和ΔTSC2 AML细胞中的蛋白质合成率显著降低(图6A)，而此时mTORC1信号没有明显改变。抑制MAT2A也阻止了胰岛素刺激合成蛋白质的能力(图6B)。在ΔTSC2HeLa细胞中敲除s -腺苷甲硫氨酸传感器（SAMTOR）不会阻止MAT2A抑制剂（MAT2Ai）显著降低ΔTSC2细胞中的蛋白质合成速率(图6C)。METTL3和METTL14过表达导致ΔTSC2 HEK293E细胞中蛋白质合成速率显著增加，而当SAM降低时，蛋白质合成速率降低(图6D)。以上结果表明依赖mTORC1 的蛋白质合成需要MAT2A活性。然而，SAM的增加对MAT2A抑制反应有负反馈作用，导致部分蛋白质显著恢复其合成速率(图6E)。以上结果表明mTORC1直接刺激SAM合成，介导蛋白质合成。

图7 在乳腺癌PDX模型中SAM损耗抑制肿瘤生长

为探究MAT2A是否可以代表mTORC1驱动肿瘤细胞的代谢依赖性，作者在不同致癌基因驱动且均激活mTORC1信号的癌细胞系中抑制MAT2A，发现MAT2A抑制以SAM依赖的方式减少癌细胞增殖(图7A-B)。此外，抑制MAT2A也显著降低了癌细胞的非锚定生长(图7C-D)。此外，与一些人的癌旁组织相比，肿瘤组织中MAT2A蛋白水平显著升高，且表现出高水平的mTORC1活性(图7E)。MAT2A的高表达与癌症患者的低总生存率相关，抑制MAT2A对不同癌细胞株具有有效的抗增殖作用。另外，乳腺癌异种移植瘤小鼠模型中也发现同样的现象(图7F-H），即抑制MAT2A明显抑制肿瘤的生长，提示MAT2A是依赖mTORC1的细胞和肿瘤生长的关键下游信号。

（三）总结

该研究通过代谢组发现mTORC1信号转导在甲硫氨酸代谢和精氨酸代谢通路的重要作用，mTORC1能通过控制MAT2A的表达来刺激主要甲基供体SAM的合成，c-MYC能直接与MAT2A的内含子1结合并促进其表达。mTORC1还能增加WTAP蛋白质的丰度，通过控制MAT2A和WTAP的水平，mTORC1的信号就能刺激m6A的修饰来促进蛋白质的合成和细胞生长，MAT2A抑制所导致的胞内SAM水平的下降会降低m6A的RNA修饰水平、蛋白质的合成率以及肿瘤的生长。该研究表明MAT2A可能成为癌症和肿瘤中的一个潜在的代谢治疗靶点。

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