植物RNA多组学研究的正确打开方式全部在这里了，套餐组合任意挑选 | 转录调控专题
多组学研究中的样本重复数建议
植物RNA多组学研究当中，实验样本为两组或多组时，一些文章可能显示的两组3V3，或多组3V3V3…，但真正做的生物学重复数肯定不止3个，都是从多个生物学重复样本中挑选3个重复性较好的样本进行下一步研究。
如果要关注差异表达基因，尤其是差异表达倍数不大的基因，一般建议每组样本设置6-8个生物学重复以上。
下面，我们看一下分析结果：
生物学重复数量与真实差异基因的关系
随着生物学重复的增加，鉴定出真实差异基因的比例由19%增加到74%。
生物学重复与差异基因倍数的关系
可以看出，T设置较大（差异倍数要求较高）时，生物学重复的影响较小；当T设置较小（差异倍数要求较低）时，生物学重复的影响就很大了。也就是说，对于差异倍数不大的差异基因，在生物学重复较多时，才更可信。
讲完生物学重复，下面我们就来看本文的重点内容——植物RNA多组学研究方案：
方案一：转录组测序 + miRNA测序
MicroRNA（miRNA）是内源性的、单链的非编码调控小分子，在生物体内通过抑制基因的表达发挥作用。每个miRNA可以有多个靶标基因，同时，一个基因也可能受多个miRNA的调节。因此，这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。
通过miRNA与mRNA联合分析，可以更加准确的分析其中的相互作用或者调控机制。首先通过miRNA测序可以鉴定miRNA，并获得 miRNA 和靶基因的关系对信息。再对miRNA与mRNA进行差异表达分析，鉴定出关键miRNA与基因，再通过miRNA-靶基因网络调控图可以直接展示 miRNA调控多个靶基因以及同一个靶基因被多个 miRNA 调控的情况。通过将这两者数据进行整合分析，可以挖掘基因表达过程中参与的调控机制。
经典案例分享：
论文标题：Integration of mRNA and miRNA analysis reveals the molecular mechanism of potato (Solanum tuberosum L.) response to alkali stress
刊登日期：2021年04月
发表杂志：International Journal of Biological Macromolecules
影响因子：8.025
研究机构：甘肃农业大学
DOI：10.1016/j.ijbiomac.2021.04.094
研究思路：
实验设计：
实验材料：青薯9号组培苗
实验方法：将组培苗接种于MS（pH＝5.6）培养基中，在22℃、光照16h/暗处理8h条件下培养；21天后，转移至pH＝8.2的MS培养基中，碱盐处理0/2/6/24h，构建碱盐胁迫模型；观察各处理组幼苗形态学变化，同时采集幼苗根部提取总RNA，建库测序，检测各组幼苗mRNA和miRNA表达变化。研究内容：
该研究构建了由20个响应碱性盐胁迫差异表达miRNA与33个差异mRNA构成的33个miRNA-靶基因对，并挖掘了“苯丙烷生物合成”、“植物激素信号转导”及“淀粉和蔗糖代谢”3个马铃薯响应碱性盐胁迫的重要通路。其中，miR4243-x及novel-m064-5p分别通过对HCT和SPS的靶向调控作用参与了马铃薯对碱性盐胁迫的应答。
该研究首次通过miRNA-mRNA关联分析对马铃薯响应碱性盐胁迫的机理进行了探究，将拓宽对马铃薯碱性盐胁迫响应生理及复杂分子机制的理解，为后续马铃薯抗盐碱栽培及其产业健康发展提供科学依据。此外，获得的大量候选miRNA及mRNA对于马铃薯耐盐碱种质资源的创新及耐盐碱品种的培育同样具有重要价值。
马铃薯对碱胁迫响应的重要途径及差异基因与相关性状的相关性
方案二：转录组测序+m6A测序
RNA m6A甲基化作为最关键的RNA甲基化修饰之一，是真核生物调节和丰富遗传信息的一种保守的转录后机制。m6A修饰具有多种生物学功能，如调控mRNA翻译、转录以及稳定性等。目前，已在多种植物中发现这种RNA修饰，参与调控不同植物的各方面生物学功能。其中，拟南芥作为植物界中研究RNA甲基化修饰的先行者，许多学者将它作为研究对象，并与最新m6A甲基化测序技术结合，证实到RNA甲基化广泛存在于拟南芥各个发育期，并揭示了RNA甲基化相关酶在特殊发育时期，如开花，叶片形成，种子发育，根部生长等过程中发挥重要作用。除了拟南芥，在其他植物中如番茄、小麦、玉米以及高粱等均发现了RNA m6A甲基化修饰。
m6A-seq是近两年来备受瞩目的一项表观组学技术，这项技术利用抗体抓取带有甲基化修饰的RNA片段，配合测序获得RNA甲基化修饰的全基因组分布特征。为了减少数据背景对于结果的干扰，m6A-seq测序通常会再做一个input对照（即相同样本进行常规转录组测序）。
早期科研人对m6A的认知停步在m6A甲基化修饰在哪些基因区域、m6A修饰程度高低比较等基础问题，随着近年m6A研究的深入大家才逐步将眼光放远，开始关注被m6A修饰的基因随着m6A修饰程度变化而发生的变化。单独的m6A组学缺少下游的被调控者信息，单独转录组则无法得知调控因素对于基因表达的作用，将这两者结合才能完整解释RNA转录调控因素对于基因表达及表型差异的调控作用，发挥出1+1>2的作用。
经典案例分享：
论文标题：Transcriptome-wide m6A methylation profile reveals regulatory networks in roots of barley under cadmium stress
刊登日期：2022年02月
发表杂志：Journal of Hazardous Materials
影响因子：14.224
研究机构：浙江大学农业与生物技术学院
DOI：10.1016/j.jhazmat.2021.127140
文章解读链接：14分用户文章：重金属镉胁迫下大麦根部m6A修饰图谱 | m6A专题
实验思路：
实验设计：
实验材料：金色大麦（GP）
实验方法：对于Cd处理，14d龄的大麦幼苗用5μM Cd2+ 在1/5的Hoagland’s溶液中处理。以未加Cd的正常条件为对照。在Cd处理或正常条件下处理7d后，用5 mM的CaCl2冲洗幼苗的根3次，然后取样。为了测定离子浓度，分别收获根和茎，在70℃的烤箱中干燥2d。为了进行m6A测序的RNA提取，将3个生物重复的新鲜根立即冷冻在液氮中，然后在-70℃下保存。
研究内容：
在镉胁迫下作物已进化出适应性策略。然而，耐镉基因的转录调控机制在很大程度上有待阐明。在该研究中，为获得生理反应和转录组范围内m6A甲基化图谱，将大麦的根系浸泡在5 μM的CdCl2中。镉处理7天后小麦根系的生长受到了抑制，这主要与Mn的吸收受到极大的抑制有关。在镉处理后，鉴定出了8151个显著修饰的m6A位点和3920个差异表达基因。在镉胁迫下全转录组m6A高甲基化受到显著诱导，并富集到终止密码子和3′ 非编码区域附近。在435个m6A修饰差异基因中，319个高甲基化基因表达上调，84个甲基化基因表达下调，表明了m6A甲基化和基因表达呈正相关。但是除了ABC转运蛋白以外，镉转运因子（HvNramp5, HvIRT1, HvHMA3, etc.）没有被m6A甲基化修饰。我们进一步发现了m6A甲基化正向调控关键的镉响应调控基因，包括成员有MAPK、WRKY和MYB。该研究提出了大麦根部在镉胁迫下的转录调控网络，这为控制作物低浓度镉积累的基因操作提供新的看法。
Cd胁迫下大麦根部m6A转录调控网络的工作模型
方案三：m6A测序+转录组测序+翻译组测序
N6-腺苷酸甲基化（m6A）是真核生物mRNA的最普遍的内部修饰，研究表明m6A可调控RNA的编辑、翻译和降解，影响mRNA的稳定性、调节蛋白质与RNA的相互作用，广泛参与了植物各个发育时期。既然m6A可调控基因的翻译，那么是否可以联合翻译组技术与m6A检测技术来研究呢？答案当然是可以的。下面就介绍一篇PBJ文章，看看大神们是如何联合这两个组学进行翻译调控研究的。
经典案例分享：
论文标题：The m6A reader MhYTP2 regulates MdMLO19 mRNA stability and antioxidant genes translation efficiency conferring powdery mildew resistance in apple
刊登日期：2022年03月
发表杂志：Plant Biotechnology Journal
影响因子：13.263
研究机构：西北农林科技大学园艺学院果树逆境生物学团队
DOI：10.1111/pbi.13733
实验设计：
实验材料：WT苹果植株和35S::MhYTP2苹果植株
实验方法：组织培养产生的WT和35S：：MhYTP2植株在MS琼脂培养基上生长90d后，将WT和35S：：MhYTP2大小相近的试管苗移栽到装有营养土的栽培盆中生长60d，之后选择大小相近的植株进行PM接种的响应试验。
从病叶上获得的白毛疫霉菌干刷健康叶片后，在相对湿度为50%、黑暗温度为28℃的条件下接种24 h，接种后15天对所有接种叶片的病情进行直观评估。在接种前后每株收获6片叶子，并立即将其冷冻在液氮中。所有冰冻样品在−80℃下保存，进行后续的生理实验、m6A-seq、RNA-seq和Ribo-seq。
实验思路：
研究内容：
研究人员前期获得了RNA结合蛋白MhYTP2超表达转基因苹果植株，发现该转基因植株具有明显的白粉病抗性。鉴于MhYTP2蛋白具有YTH结构域，其与拟南芥中已报道的m6A阅读蛋白ECT2具有高同源性，研究人员首先证明了苹果MhYTP2同样具有m6A结合功能；其次，发现MhYTP2的超表达会改变m6A甲基化酶和去甲基化酶相关基因的表达。通过开展m6A-seq，发现MhYTP2过表达提高了一批mRNA的m6A修饰水平和翻译效率。同时，外显子区域的m6A修饰改变可能与mRNA的稳定性呈负相关，而非翻译区（UTR）的m6A变化与mRNA的丰度呈正相关。此外，MhYTP2能够与含m6A修饰白粉病感病基因MdMLO19和MdMLO19-X1的mRNAs结合，并加速其降解；MhYTP2还能够结合谷氨酸脱氢酶1基因MdGDH1L的mRNA，并提高其翻译效率，增加蛋白积累，提高转基因植株的抗氧化能力。综上所述，该研究揭示了苹果m6A基因谱、MhYTP2对m6A基因谱的影响以及m6A在调控苹果白粉病感病基因MdMLO19 mRNA稳定性和抗氧化相关基因翻译效率中的作用。
方案四：转录组测序+miRNA测序+降解组测序
寻找miRNA靶基因的常规手段最常见的有两类，一类是生信手段：基于序列信息通过Target Scan、miRanda等软件预测。一个miRNA可以靶向多个mRNA，一个mRNA也可以被多个miRNA靶向结合，所以通过生信预测出来的结果信息量会很庞大，且假阳性高，需要在海量的靶向关系中找到关键基因来做实验验证。另一类是实验手段：如利用AGO蛋白做RIP（RNA免疫共沉淀），以及CLIP、生物素下拉等方法。实验方法一般操作复杂，依赖抗体与试剂的好坏与质量，且人为操作过程中影响因素太多，除了这些外界因素外，还受抗体特异性、交联效率，背景噪音等因素影响，属实有点费力不一定讨好的样子。
而降解组测序可以同时解决上述手段存在的问题。通量高，结果准，不需要做复杂的实验。且降解组测序不需要生物学重复，如果同时做转录组或者Small RNA测序，每个组的生物学重复混成一份样品做降解组测序就行！
经典案例分享：
论文标题：Integrated transcriptome, small RNA and degradome sequencing approaches provide insights into Ascochyta blight resistance in chickpea
刊登日期：2018年10月
发表杂志：Plant Biotechnology Journal
影响因子：13.263
研究机构：印度半干旱热带国际作物研究所基因组和系统生物学卓越中心
DOI：10.1111/pbi.13026
文章解读链接：PBJ（IF=13）：鹰嘴豆转录组+miRNA+降解组多组学整合分析 | 转录调控专题
实验设计：
实验材料：4个鹰嘴豆基因型和1个AB胁迫表型相反的导入系
实验方法：将不同类型的10天龄幼苗在20℃环境条件下驯化24h，光照12h后，喷洒兔疫霉孢子悬浮液，直至产流。在第3天和第7天收获幼苗的气生组织。除了接种AB的样品外，还从两个时间点采集了对照(未接种)样品。组织在-80℃下保存，直到RNA分离。随后进行RNA-seq、miRNA-seq和降解组测序。
实验思路：
研究内容：
该研究首次尝试整合mRNA和miRNA表达数据以及degradome分析，确定了鹰嘴豆对AB应激的基因型特异性反应，而不是抗性和易感基因型的共同反应，并且明确在两种抗性基因型中（ICCV 05530和ILC 3279）表现出相似表达的基因，但在BC3F6基因型中表达不同。miRNA-seq和RNA-seq综合分析确定了12对miRNA-mRNA，通过降解组验证确定了5对miRNA-mRNA可以作为培育鹰嘴豆具有AB抗性的候选基因。
在沙门氏菌与鹰嘴豆在抗性基因中相互作用期间发生的各种生理和生化事件的级联摘要
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