m6A修饰介导DNA去甲基化调控染色质可及性| m6A专题

论文标题：RNA m6A regulates transcription via DNA demethylation and chromatin accessibility

刊登日期：2022年9月

发表杂志：Nature Genetics

影响因子：41.307

研究机构：中山大学肿瘤中心

技术手段：m6A测序、WGBS、ATAC测序、转录组测序

研究背景

整合染色质可及性、转录因子和表观遗传修饰的转录调控对于建立和维持细胞身份至关重要。其中转录调控是一个至关重要的过程，这一过程中表观遗传修饰发挥着重要作用。然而，不同表观遗传修饰之间的相互作用及其对转录调控的贡献仍然难以捉摸。

作为mRNA上丰度最高的内部修饰类型，RNA N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine m6A) 已被证实可以通过影响mRNA的结构、稳定性、可变剪切、出核转运及翻译效率，而广泛参与各种生理和病理过程的调控。然而，在调节染色质可及性和基因转录方面，RNA 修饰是否以及如何与 DNA 甲基化相互作用机制尚不清楚。

主要研究内容

1. RNA m6A水平与DNA 5mC水平呈负相关

图1 RNA m6A修饰水平与DNA 5mC水平呈反相关

为了探究RNA m6A和DNA 5mC之间潜在的相互作用，作者首先系统地分析了公共数据集。通过比较基因组位置，作者发现大量的m6A连锁基因座与CPGS重叠，但RNA m6A与DNA 5mC水平呈负相关。此外，随着CPGS接近m6A峰，5mC水平显著下降。由于m6A可以调节染色质状态，作者推测RNA m6A也可能调控DNA 5mC，从而影响染色质的可及化。为了验证这一假设，作者采用ELISA和LC-MS/MS检测了在沉默或不沉默METTL3（m6A甲基化转移酶）的细胞中的DNA 5mC水平。结果表明，METTL3的耗竭导致DNA 5mC水平和5mC/C比率显著增加(图1a、b)。此外，作者发现，METTL14（m6A甲基化转移酶）的耗竭也会导致DNA 5mC水平显著增加，而沉默m6A去甲基酶FTO则导致相反的结果。METTL3耗竭导致细胞中DNA 5mC水平的增加可以通过野生型METTL3的异位表达来修复(图1b)。以上结果表明，METTL3、METTL14和FTO很可能是通过RNA m6A修饰影响DNA 5mC水平。

进一步，作者在METTL3基因敲除的细胞中进行了平行的RNA m6A测序和WGBS测序。与上述结果一致(图1a，b)，METTL3敲除导致整体RNA m6A水平显著降低，DNA 5mC水平上升(图1c，d），以及更多的差异高甲基化区域（DMRs）(图1d)。值得注意的是，作者发现大多数高甲基化的DMRs和m6A峰在分布上有很大的相似性，它们优先位于RNA的编码序列(CDS)和3ʹUTR区域。有趣的是，当METTL3耗竭时，随着CpG到m6A峰距离的减少，RNA m6A峰附近的高甲基化DMRs中的DNA 5mC水平显著增加(图1e)。

与对照相比，METTL3基因敲除细胞中m6A峰中心附近区域的差异DNA甲基化水平显著高于远端区域。然而，METTL3基因敲除并没有显著改变非m6A区域的CPGS甲基化水平。通常，高甲基化的DMRS优先与低甲基化的m6A峰重叠(图1f)。然后作者将差异甲基化区域映射到最近的基因，发现超过80%的m6a峰基因也包含hyper-DMR簇(图1G)。作者选择了SATB2、RpiA、WNT7B、BCL6、FAT4和SAMD9L基因进行验证，发现METTL3敲除显著降低了RNA m6A水平，但增加了DNA 5mC水平；野生型而非突变型的METTL3的异位表达可以逆转这些变化。综上所述，这些发现表明，METTL3耗竭相关的DNA 5mC增加与RNA m6A有关。

2. Tet1活性与全基因组RNA m6A水平相关

图2 在KYSE30细胞中，DNA去甲基化酶TET1的活性与全基因组RNA m6A水平相关

由于DNA 5mC可以被DNA去甲基化酶TET1/2/320去甲基化，作者研究了这些酶是否在RNA m6 A和DNA 5mC相互作用的过程中发挥作用。ChIP-seq测序结果发现只有TET1与METTL3重叠，接近m6A峰这表明可能是TET1参与了RNA m6 A和DNA 5mC的相互作用

然后，作者使用Cut&Tag检查了METTL3和TET1在细胞中的染色质占有率。综合分析表明，TET1结合和m6A水平之间存在正相关和重叠(图2a，b)。此外作者发现>65%的TET1靶基因具有m6 A(图2c)，并且METTL3的CUT&Tag信号强度与TET1的信号强度呈正相关(图2d)。大多数TET1(97.1%)与METTL3共定位，并局限于METTL3峰的中心(例如，AKIRN2和THEM6)(图2g，f)。在分析公共小鼠胚胎干细胞(MESC)数据时也得到了类似的结果。此外，作者还发现，在METTL3基因敲除的食道鳞状细胞癌(ESCC)细胞中，TET1染色质结合水平显著降低，这可以被野生型而非突变体METTL3改善；降低的结合往往位于m6A峰的中心(图2f)。验证分析再次表明，m6A修饰的基因显著减少了TET1与METTL3基因敲除的结合，这种现象可以通过野生型而不是突变型METTL3的异位表达来改善；相反，CNGA4（无m6A修饰）的TET1结合水平没有改变。此外，作者发现METTL3敲除后DNA 5mC水平显著增加，但TET1过表达时DNA 5mC水平下降，而异位TET1表达并不改变METTL3敲除细胞中DNA 5mC水平的增加。

此外，作者测量了5hmC、5fC和5caC的水平，结果显示，METTL3敲除细胞中5hmC、5fC和5caC水平以m6 A甲基转移酶活性依赖的方式显著降低，表明TET1和METTL3在此过程中具有耦合作用。在METTL3缺失导致的低甲基化基因中，大多数低5hmC基因具有高5mC（图2j），进一步证明了METTL3沉积的m6 A修饰在tet1介导的DNA去甲基化中共存。由于一些组蛋白修饰也可能影响DNA甲基化，作者也研究了它们对DNA甲基化的影响，结果表明组蛋白甲基化酶的消耗，单独或与METTL3消耗结合，导致组蛋白修饰显著减少。

3. M6A共转录指导TET1去甲基化5mC

图3 RNA m6A共转录引导TET1去甲基化DNA胞嘧啶

图4 FXR1募集Tet1对DNA进行去甲基化

作者测试了m6A形成是否共转录招募TET1。通过使用Cut&Tag检查Pol II的定位，发现82.9%的TET1结合位点是Pol II的靶点(图3A)，TET1定位在Pol II的中心(图3B)。接下来，作者研究了RNA m6A在这一过程中的作用，发现METTL3的缺失也导致了m6A甲基转移酶依赖的TET1染色质结合减少(图3D)。这些结果表明，TET1需要由METTL3形成的RNA m6A以共转录的方式与靶染色质结合。

下一步，作者探究了TET1是否被m6A募集。TET1的免疫共沉淀结合蛋白质组学分析确定了13个可能与TET1相互作用的核蛋白。Western印迹分析表明TET1和FXR1之间存在直接的DNA和RNA相互作用，但其他核蛋白之间没有这种相互作用(图4B)。通过对FXR1 PAR-CliP与Cut&Tag数据的综合分析表明，FXR1-DNA相互作用的位置与其RNA结合位点非常吻合(图4E)。

对Cut&Tag数据的进一步分析表明，大多数FXR1和TET1结合区重叠并呈正相关(图4f-h)。WGBS分析了全局DNA 5mC水平，Cut&Tag方法分析了FXR1敲除或不敲除细胞中的TET1结合位点，结果表明FXR1缺失显著增加了DNA 5mC，减少了TET1结合，这可以通过FXR1的恢复表达来挽救(图4i，j)。验证结果表明，当该蛋白与引导RNA定位到定义的靶点时(图4k)，TET1也会被募集(图4l)，导致DNA 5mC水平降低(图4m)。

m6A ELISA和MERIP测序结果分析了FXR1或TET1基因敲除细胞中的m6A水平，发现FXR1没有显著影响，但TET1缺失显著降低了m6A水平，表明TET1在调节m6A修饰方面发挥了复杂的作用，这与TET1具有多个功能的事实一致。以上证明了FXR1和TET1之间的功能相互作用，FXR1可能可以募集TET1在RNA中产生m6A修饰从而对DNA 5mC进行去甲基化。

4. m6A-5mC相互作用在转录调控中的作用

图5 RNA m6A的形成与DNA去甲基化结合，在染色质状态和基因转录中起作用 

图6 ESCC中RNA m6A形成结合DNA去甲基化验证转录调控

为了阐明RNA和DNA之间染色质调控相互作用对基因表达的影响，作者首先研究了METTL3、TET1或FXR1基因敲除对转录调控的影响。RNA测序结果表明，许多差异表达的RNA与METTL3、TET1或FXR1耗尽相关(图5a)。其次，ATAC测序结果表明，METTL3、TET1或FXR1基因敲除细胞中染色质的可及性发生了显著性变化。此外，TET1或FXR1基因敲除导致了与METTL3基因敲除一样的结果，表明METTL3、FXR1和TET1在模型中具有协同效应(图5b)。通过对RNA-seq和ATAC-seq数据联合分析，发现染色质可及化的变化与基因表达的变化相对应，即可及性的获得与基因转录和可访问性的丧失对应于基因转录的减少(图5c)。以上结果表明m6A-5mC相互作用通过染色质重塑在基因转录调控中发挥作用。

最后，作者对8对食管癌组织和正常组织进行了m6A测序和WGBS分析。结果显示ESCC的DNA甲基化水平显著低于邻近正常组织，但m6A水平高于邻近正常组织(图6a，b)，表明RNA m6A和DNA 5mC修饰可能是相互排斥的，与上述体外研究结果一致。大多数RNA m6A峰在其区域的±2000bp内有CpGs，其中65.4%的RNA m6A修饰水平在每个峰的范围内与CpGs的甲基化水平呈负相关(图6c)。此外，作者发现，在甲基化水平与m6 A峰呈负相关的CpGs，TET1或FXR1 RNA水平与DNA甲基化水平之间的相关性强于与m6 A峰的相关性(图6d，e)。与正常样本相比，作者在ESCC中鉴定了368个与RNA m6 A高甲基化和DNA低甲基化相关的基因；其中，80%的基因在ESCC中的表达水平高于邻近正常组织(图6F)。这些基因的功能注释表明，主要富集在一些经典癌症相关途径，如癌症中的转录失调、PI3K-AKT和转化生长因子-β途径(图6g)。这些结果表明，RNA m6A和DNA 5mC之间的串扰可能在ESCC发育相关基因的异常调控中发挥重要作用。

结论

该研究证明了METTL3介导的RNA N6-甲基腺苷(M6A)的形成导致正常细胞和癌细胞附近基因组位置的DNA去甲基化，这是通过m6A阅读器FXR1和DNA 5-甲基胞嘧啶双加氧酶TET1之间的相互作用而介导的。在识别RNA m6A后，FXR1将TET1招募到基因组位置以使DNA去甲基化，导致染色质可及性重新编程和基因转录。因此，该研究描述了一种由RNA m6A的形成和DNA去甲基化介导的染色质可及性和基因转录的调节机制，强调了RNA m6A和DNA修饰之间的串扰在生理和发病过程中的重要性。

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