Immunity：FFPE空间转录组揭示肾细胞癌异质性| 空间转录组专题

期刊名称：Immunity

影响因子：43.474

发表时间：2022

所用组学：Spatial Gene Expression for FFPE

癌症的发生是一个十分复杂的细胞发生突变成为肿瘤细胞的过程，这些突变促使其处于失控的状态；此外，细胞的突变也会刺激患者体内的先天和后天免疫反应从而达到清除肿瘤细胞的目的。随着研究的深入，目前认为在非淋巴组织中存在的由免疫细胞聚成的一个三级淋巴结构（TLS），而TLS也被证明与预后效果有联系。

一、背景介绍

TLS存在于自身免疫性疾病、慢性感染、移植物排斥反应和癌症中遭受慢性炎症和抗原持久性的组织中。肿瘤内TLS的存在与许多癌症类型的良好预后相关。

TLS结构包含T细胞区和B细胞区，其中

T细胞区：由T细胞，DC细胞和成纤维网状细胞组成

B细胞区：由生发中心，浆细胞，抗体和肿瘤抗原形成的免疫复合物，滤泡DC组成。

二、研究结果

01



RCC肿瘤微环境的空间转录组特征

为了分析TLS对肿瘤微环境的影响，作者采用10x Genomics空间转录组学对12个ccRCC原发肿瘤冷冻切片和12个FFPE切片进行了探究。可将癌症类型划分成TLS+冻存肿瘤, TLS+ FFPE 肿瘤和TLS-冻存肿瘤。Ca9是ccRCC肿瘤细胞的标志物，在肿瘤切片中分布均匀（图1B，E，H）。在图1所示的TLS+肿瘤中，B细胞和T细胞基因优先在TLS中表达（图1C和F）。在FFPE和冷冻保存的肿瘤样本中也发现了这一现象。单核细胞在TLS中也有富集现象，而NK细胞则分布在整个肿瘤切片中。内皮细胞和中性粒细胞在TLS区域分布均匀但富集程度较低，纤维母细胞在TLS区高表达（图1C和F）。TLS-肿瘤没有表现出这种有组织的模式，MCP-counter分析显示在该肿瘤内B细胞呈现分析广泛但表达量低的特征，以及其他免疫和基质细胞特征的分散定位。这些不同的TME空间组织模式在8个TLS+和4个TLS-冷冻肿瘤以及10个TLS+和2个TLS- FFPE肿瘤中结果一致，这表明TLS与具有B细胞、T细胞和成纤维细胞特征的表达有关。

图1.肿瘤微环境中免疫细胞群和基质细胞群的空间转录组学

02



免疫球蛋白（Ig）基因的空间表达特征

为了确定TLS在肿瘤中的转录特征，作者在TLS和肿瘤区域进行了差异表达基因分析（图2A和F）。通过交叉验证一共鉴定到了包括12种免疫球蛋白基因、5个B细胞标记基因、2个T细胞标记基因、2个成纤维细胞标记基因、2个补体蛋白编码基因等29个基因在TLS结构特异性表达。且以上基因在冷冻肿瘤样本与FFPE肿瘤样本都得到了验证。

Ig和B细胞相关基因在TLS区域中表达促使作者后续实验重点研究了B细胞。首先作者探究了TLS中不同的B细胞亚型。作者发现原始B细胞相关基因很少表达，尽管与TLS显著相关，且FCRL4+记忆B细胞、GC B细胞和浆母细胞特征与TLS密切相关（图2D）。PC相关基因MZB1在TLS中表达较高，在肿瘤区域整体表达较低，这也在FFPE肿瘤中发现了类似的结果（图2I）。然而，在肿瘤内不同位置发现了大量弥散的、距离TLS较远的MZB1表达。MZB1是浆细胞特征的一部分，在PCs中高表达。由于浆细胞局限于TLS区域，且在TLS外发现MZB1的高表达，很可能表达MZB1的PC不仅存在于TLS中，而且存在于肿瘤细胞中。由于PCs的主要功能是产生抗体，因此作者分析了免疫球蛋白基因的空间表达。IGHM几乎只在TLS区域表达，加强了TLS中非交换B细胞的存在，而IGHG1、IGHA1和pan Ig基因在TLS区域高表达，但在肿瘤中也有远距离表达。IGHG1和IGHA1的表达结果表明，同型转换的PCs已经在TLS中形成，并在远端肿瘤细胞群体中扩散开来。

由于有报道称CXCL12和PC在骨髓，淋巴髓带和慢性炎症组织中与迁移和保留有关，作者分析了CXCL12的表达，发现它与MZB1共定位。作者为了进一步评估这些基因表达之间的空间共存特征。结果表明TLS特征与MZB1、成纤维细胞和CXCL12的共定位，还证实了成纤维细胞与CXCL12的共定位，MZB1与成纤维细胞的共定位，MZB1与CXCL12在TLS较远位置共定位距离。并且这一结果也在其他TLS+肿瘤样本被证实，而在TLS-肿瘤中没有显示。综上，在TLS+肿瘤中，表达IGHG1和IGHA1的PC存在于TLS附近，并可能与成纤维细胞具有互作关系在肿瘤内扩散。

图2.TLS与B细胞亚型、浆细胞、免疫球蛋白和成纤维细胞的基因特征的空间共定位

03



空间B细胞受体（BCR）谱识别TLS区域体细胞高突变和克隆选择

B细胞成熟亚型和PCs在TLS中的共定位暗示了原位B细胞适应性免疫的产生。为了证明这一点，作者研究BCR的核苷酸序列。

MiXCR鉴定到了一系列独特的克隆型。在TLS+肿瘤中发现了最多的独特克隆型和总Ig计数。在TLS区域也发现了数量最多的独特轻链克隆型（图3A）。通过测量Ig轻链序列V区突变计数与V种系基因的比较来评估B细胞的成熟度。V基因突变数中值在TLS区域显示低至中值水平，而在肿瘤区域，大多数高度突变的序列距离TLS较远。尽管如此，在TLS区域检测到包括高度突变序列在内的全范围突变，而大多数距离TLS较远的Ig转录本富集在高度突变序列中，这表明TLS中发生了体细胞高突变，并提示突变的PCs在整个肿瘤中扩散。作者进一步探究了47个ccRCC肿瘤中50个转录组的轻和重链突变计数，分为TLS高和TLS低。无论是VL还是VH基因，高TLS肿瘤的整体体细胞高突变水平显著高于低TLS肿瘤（图3D）。为了确定体细胞高突变是否伴随着克隆型选择，作者研究了大量50个转录组数据的IgH库。高TLS的样本库既表现出大量的克隆型总计数，也表现出更高比例的克隆型。事实上，30%的高TLS肿瘤被鉴定超过100次的克隆型所占据，而在低TLS肿瘤中只有1%，这表明在高TLS样本中存在持续的免疫反应（图3E）。

最后，为了确定扩增的IgH克隆型的克隆关系和位置，作者对30个空间转录组进行了克隆性评估。克隆性定义为VH基因家族相同，JH基因相同，CDR3长度相同，VH序列之间CDR3 核苷酸序列最大差异为15%。共鉴定出31个克隆家族，具有2至16个独特成员（图3F）。在一个科中，一些克隆可以在多达20个不同的空间位置检测到多达80次。在基因表达芯片上定位的IgH克隆型表明了同一家族的克隆型富集在TLS附近，并在远端随机分布。

在TLS低的样本中，检测到的克隆型数量非常低，阻碍了Ig转录本的分析，也证明了肿瘤内PCs主要是在TLS中生成。总之，这些数据证实原位TLS介导的成熟，允许选择、克隆扩增和被选择的PCs在肿瘤的不同区域内分布。

图3.空间BCR分析确定了在TLS区域发生的体细胞高突变和克隆扩增，以及在选定肿瘤区的克隆

04



浆细胞从 TLS 沿成纤维细胞分布迁移

为了分析肿瘤内PCs和成纤维细胞的位置以及CXCL12的原位表达，作者在FFPE肿瘤切片上使用多重IF标记，使用多发性骨髓瘤癌基因1 (MUM1) (IRF4)作为PC的特异性标记基因，使用COL1 (Col1a)作为成纤维细胞的特异性标记基因。作者采用连续的CD3/CD20显色标记，结果表明在TLS区域检测到双阳性的MUM1+ IgG+ PCs和少量的MUM1+ IgA+ PCs（图4A）。在这些区域内同样观察到COL1+/CXCL12+ 成纤维细胞与MUM1+ PCs并列。此外，在COL1+ CXCL12+成纤维细胞网状细胞中，沿成纤维细胞轨道排列的PCs被证明与TLS有距离，从而证明了它们在肿瘤细胞中的分布。为了定量评估PCs和成纤维细胞之间的空间关系，作者对DAPI/MUM1/IgG/IgA IF染色样本进行成纤维细胞核AI检测。成纤维细胞核的检测绘制了COL1+成纤维细胞的轨迹（图4D）。绝大多数的PCs非常接近成纤维细胞的细胞核。综上，表明Ig和成纤维细胞转录本的共表达，以及成纤维细胞转录本和CXCL12的共表达，并验证了PCs在TLS内的位置，以及通过空间转录组学探究了成纤维细胞网状细胞（FRC）轨迹。

图4.TLS+肿瘤中pc与成纤维细胞和IgG肿瘤染色的共定位

05



TLS和产生IgG的PCs与结合到凋亡肿瘤细胞IgG抗体和对免疫治疗的应答相关

为了进一步研究TLS与肿瘤内PCs和Ig染色之间的联系，作者首先探究了TLS的成熟度。成熟TLS的特征是GC包含一个由T细胞区包围的B细胞区，其中CD4+ PD1+ T细胞，CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh细胞，以及CXCL13生成细胞（图5B）。GC区的特征是CD23+滤泡树突状细胞（FDC）、BCL6+ CD20+ B细胞和在外周检测到的PNAd+ HEVs（图5C）。作者研究了103例肿瘤中TLS的存在与PCs密度之间的相关性。结果表明TLS与MUM1+ IgG+细胞密度和MUM1+ IgA细胞密度之间存在显著的相关性。

图5.成熟的TLS+肿瘤显示出更多的转换MUM1+ PC

在肿瘤巢周围检测到高密度产生IgG的PCs，以及在肿瘤细胞中观察到的IgG，促使作者研究抗肿瘤抗体的存在。在TLS+肿瘤中观察到偶联抗人IgG在CAIX+肿瘤细胞膜上的标记，而在TLS肿瘤中没有观察到标记。随后对103个肿瘤的定量研究显示，与TLS-肿瘤相比，TLS+肿瘤细胞的IgG阳性比例高达100%。在TLS+和TLS-肿瘤中均观察到较弱的IgA标记。此外，肿瘤细胞上的IgG标记与MUM1+ IgG+ PCs浸润肿瘤之间存在显著相关性，而IgA标记非常低（图6D）。

为了揭示肿瘤结合IgG抗体的潜在功能，作者采用一种检测cleaved caspase 3的抗体，寻找肿瘤细胞凋亡的迹象。图6E显示了TLS+和TLS-肿瘤中裂解的caspase 3的标记。IgG染色大于60%的肿瘤中，caspase 3+肿瘤细胞的裂解密度明显高于IgG+肿瘤细胞小于60%的肿瘤。作者讨论了可能在诱导肿瘤细胞凋亡中起作用的机制的问题。由于巨噬细胞和NK细胞是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的主要效应物，作者分别评估了76个和98个肿瘤上CD68+巨噬细胞和NKp46+ NK细胞的总密度，发现与裂解的caspase-3+肿瘤细胞的密度没有相关性。然而，作者发现，与凋亡细胞数量多但 IgG染色肿瘤细胞比例低的肿瘤相比，凋亡细胞数量多且 IgG染色肿瘤细胞比例高的肿瘤更容易被CD68+巨噬细胞浸润。此外，结果表明与凋亡细胞数量多但IgG染色肿瘤细胞比例低的肿瘤相比，凋亡细胞数量多且IgG染色肿瘤细胞比例高的肿瘤更容易被CD68+巨噬细胞浸润。NK细胞的密度低于巨噬细胞，并且没有表现出这种相关性。作者发现13.6%的凋亡肿瘤细胞位于巨噬细胞的25毫米以下，而作者没有观察到NK细胞和凋亡肿瘤细胞之间的近距离性。图6G显示了CD68+巨噬细胞与IgG染色/裂解的caspase 3+肿瘤细胞之间的密切关系。

为了评估IgG肿瘤染色对ICI治疗患者的影响，作者评估了来自NI治疗患者的35个肿瘤和来自nivolumab治疗患者的16个肿瘤。作者选择平均IgG肿瘤染色作为界限。对于NI治疗的患者，作者证明了治疗反应之间的显著相关性，IgG肿瘤细胞标记高于平均值的患者的客观反应为62%，而IgG肿瘤细胞标记低于平均值的OR为18%（OR：完全和部分反应），以及高IgG肿瘤细胞染色的患者的PFS明显长于低IgG肿瘤细胞染色的患者。而，在51例接受ICI治疗的患者中，无论是Nivolumab还是NI治疗，均观察到高肿瘤染色患者的生存期曲线明显更长。

图6.与未成熟或无TLS的肿瘤相比，TLS肿瘤的IgG+ CAIX+肿瘤细胞染色增加与肿瘤细胞死亡和对ICI的反应之间的关系

好消息来啦！！！联川生物FFPE空间转录组测序闪亮登场

FFPE是生物学尤其是医学领域常见的组织保存形式，但是这一保存方式存在着DNA/RNA 降解的情况，导致FFPE样本的检测手段非常受限。基于此，联川生物空间转录组测序平台再添一利器之Visium FFPE，且10x Visium CytAssist 也已完成装机，并正式投入运行。接下来让我们一起来探索FFPE空间转录组测序的魅力所在吧！

FFPE空间转录组测序流程

1、样本准备：将FFPE组织切片放置在Visium基因表达玻片上，并进行组织学成像（通过H&E染色获得形态背景）；

2、探针杂交：Visium FFPE 玻片上的每个捕获区都有一个阵列，其中含有与RNA结合的捕获探针（RTL）。RTL有两段组成分别是LHS(左端探针)和RHS（右端探针）。左端探针有read 2结构，右端探针有polyA结构。探针杂交后，mRNA的两段连续探针只有同时被杂交之后才会进行连接，若只有其中一段被捕获，则无法进行建库，显著降低假阳性结果，RTL探针组确保了高特异性和高灵敏度；

左端探针 (LHS）：Read 2S（提供扩增引物的结合位点） + 与mRNA互补配对序列

右端探针 (RHS）：PolyA（与捕获序列的poly(dT)结合） + 与mRNA互补配对的序列

3、组织透化及文库构建：对组织进行透化处理，以释放连接的探针对，使其与玻片上的捕获探针（UMI和Barcode）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，从而制备测序文库；

4、数据可视化：通过特有的分析软件将空间层面的基因表达结果和形态学的结果结合在一起，进行可视化展示；

FFPE空间转录组测序流程

FFPE空间转录组优势

• 采用双探针结合的方式，有效提高了样本检测的高灵敏度和高特异性；

• 可以对长期保存的生物库样本进行重新分析，此外还可以开展大量的回顾性研究，追踪相应的生物过程；

• 可与其他的生物学实验相结合来观察基因表达和形态背景；

• 可针对整张FFPE组织切片进行探究，全面解析样本中重要的生物学信息；

10x Visium CytAssist优势

• 将转录组和蛋白质组分析物从标准载玻片自动转移到Visium玻片的捕获区域，简化样本处理；

• 无需在Visium玻片上直接切片，将样本兼容性扩展到贴有切片的载玻片；

• 通过标准的组织学技术预先筛选组织切片，选择出最有生物学意义的切片，从而最大限度地获得Visium实验的见解；

• 使用CytAssist专用玻片和试剂，每次运行可从最多两张FFPE组织切片中精确捕获分析物，而时间不到一小时；

• 人DV200的质控要求降为>30%，允许检测更多长期保存的高度降解的样本；

10x Visium CytAssist

10x Visium CytAssist适用样本类型

• 石蜡包埋的样本；

• 已经保存在普通玻片上的FFPE样本；

• 贴在普通的玻片上的FFPE样本，通过H&E染色或者免疫荧光染色，选取感兴趣的切片，然后再将感兴趣的切片转移到Visium芯片上，解决选片困扰；

• 选取切片的一部分区域转移到Visium芯片上。

FFPE空间转录组样本指南

1.整个石蜡包埋的样本：4℃或室温封装完全寄送至联川生物实验室

2.石蜡包埋的白片和贴片

• RNA质检：切片厚度为10µm；

  ① 组织较小：≤6.5 x 6.5mm：~4片切片

  ② 组织较大：≥6.5 x 6.5 mm：1-2片切片

• 基因表达切片：切片厚度为5µm；

3.已保存的玻片

   玻片保存在玻片盒中，室温寄送至联川生物实验室

Tips：目前联川生物基于Visium CytAssist的空间转录组测序实验只兼容人的样本

相关阅读

关于联川

杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。空间转录组测序作为联川战略发展方向，目前已经搭建针对新鲜组织样本和FFPE样本的空间转录组测序平台，有着丰富的样本处理经验，且能充分发挥自身优势，为客户提供最优质的服务。目前已经与多个科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系。

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由