国自然2023热点——免费给你“蹭”的研究新热点「血液微生物组」
人体所具有的的微生物数量和基因总数远超于人体本身所具有的细胞数，它们通过各种方式影响着人类健康。随着研究技术革新，微生物的各项研究成果也是频频登上各大主刊，说明肠道、口腔、组织和血液等含有的微生物已成为当前生命科学/基础医学研究的热点之一。血液微生物作为微生物组研究的重要项目之一，阐明血液微生物与各项疾病的因果关系在基因筛查、诊断、治疗及靶向药等医疗技术层面具有重要价值。
血液在机体的整个生命活动中至关重要，它执行着物质运输、缓冲、参与凝血和免疫作用等功能，机体的生理和病理变化往往引起血液成分的改变，因此检测血液成分（包括其中的遗传物质）具有重要的临床意义。传统观念中认为血液是一个无菌的环境，血液中出现微生物会被认为是病原感染的指征，然而有关健康人或非感染性疾病患者血液中存在微生物的证据正在稳步积累。Panaiotov等人报道在健康人的血液中存在由两个真菌门（担子菌门和子囊菌门）主导的真菌微生物组(Panaiotov et al., 2018)。又陆续报道健康人和不同疾病患者（糖尿病、心血管疾病、哮喘、肝纤维化、肝硬化、哮喘、阿尔兹海默症等）血液中存在微生物(Velmurugan et al., 2020)。健康的肠道菌群和健康的血液菌群在细菌多样性上存在很大差异，健康者血液菌群主要是变形菌门等，而且还发现了病毒、古菌和真菌（图1）。微生物可能存在多种方式进入血液，近期研究发现血液微生物与皮肤和口腔微生物的数据最为接近(Whittle et al., 2019)。这表明在正常生理过程中来自这些生境的易位比来自肠道的更多。另外，人体80%的微生物处于肠道，肠道细菌也可以通过树突状细胞、肠粘膜分泌杯状细胞和肠粘膜相关淋巴样细胞向血液传递(Castillo et al., 2019)。人体细胞通透性增加、身体生理病理机能改变等都会增加微生物进入体内的机会。详细内容见血液中的微生物从何而来？| 血液微生物组。
图1 健康人体内的微生物群
前面介绍了健康人或非感染性疾病患者血液存在微生物以及微生物进入血液中的可能方式，血液微生物可能通过“肠漏理论”的方式进入血液，也就是肠道通透性增加导致。已报道的血液微生物群占主导的是变形菌门，其次是放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门(Velmurugan et al., 2020)。血液中红细胞、白细胞层和血浆中的细菌多样性显著不同，且在不同血液微生物组研究结果类似，表明可能存在着血液微生物群核心谱，它是独立于研究环境或分析方法的(Goraya et al., 2022)。
健康人血液微生物对正常机体会有影响吗？血液微生物失调会造成怎样的结果？健康人血液微生物在正常生理和免疫中起关键作用(Potgieter et al., 2015)。血液微生物失调会通过前文所述“肠漏理论”引发其他疾病，有害菌产生的神经毒素、致癌物质和游离抗原等穿过肠道屏障可能会导致慢性炎症，从而引起代谢紊乱，引发糖尿病、胰腺炎、肝硬化和心血管病等（图2）(Goraya et al., 2022)。此外，Dominy等人报道阿尔茨海默症患者的脑组织中存在牙龈卟啉单胞菌（导致牙周炎的细菌），这表明该细菌可以通过血液从口腔转移到脑(Dominy et al., 2019)。
现在有多项研究表明肠道微生物群可能通过其对免疫系统的作用而影响肿瘤的发生发展，那么血液中的微生物信号能不能作为肿瘤诊断的工具呢？Poore等人发文揭示在多种人类癌症的血液中存在识别的微生物DNA特征，发现早期癌症阶段可以从血液中读取出特定的微生物核酸特征，通过建立33个癌种18000份以上的样本建立机器学习模型能够以86%的敏感度鉴别出肺癌（Poore G D et al., 2020），这些特征能够增强现有的临床诊断效力。此外，Ajay Goel等人首次发现患者会出现血液循环微生物5种特异性菌种失调，开发了基于血液微生物DNA特征开发食管腺癌诊断和预后工具并具有优异性能（Zaidi AH et al., 2022）。血液循环微生物DNA可作肿瘤标志物？| 血液微生物组
图2 癌症微生物特征
除了肿瘤以外，血液微生物在帕金森（PD）、脓毒症等疾病患者的发病机理和诊断上都有重要研究，Yiwei Q等人研究表明血液菌群与粪便菌群组合可以更好区分PD患者，并且具有特定特征的菌属与情绪障碍程度有关（Yiwei Q et al., 2018）。Yan G等人在疑似脓毒症患儿的血液中检测到病原体微生物DNA特征，可作为诊断工具从而提示患儿存在血流感染（Yan G et al., 2021）。在重症急性胰腺炎患者中，通过16S测序分析了血液微生物发现患者微生物多样性比健康人群少，并且在与健康对照组相比病例组的拟杆菌（Bacteroides）和梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski）丰度增加，放线菌（Actinomycete）和黄杆菌（Flavobacterium Bergey）减少(Li et al.，2018)。通过检测到这些优势菌群的强烈变化暗示了胰腺炎患者血液微生物群失调。其他各项研究证明血液微生物群的改变与炎症性肠炎、心血管和糖尿病等发病率的增加有关，详情见1969-2019年血液微生物组研究纵览 | 血液微生物组。综上表明，从血浆中分离出的循环微生物DNA（cmDNA）可作为与肿瘤等疾病检测的非侵入性生物标志物，同时通过了解多种疾病患者（如糖尿病、脓毒症、肝硬化、急性胰腺炎、精神分裂症、双相情感障碍症和哮喘患者等）和健康人群的血液微生物群，供大家全景了解血液微生物组研究的方法和进展，更好地站在前人的肩膀上设计自己的血液微生物组课题。
正如1969-2019年血液微生物组研究纵览 | 血液微生物组所述，研究人员利用各种方式去描述血液中微生物组，如组培法、qPCR-荧光探针法、放射性同位素标记等方式，但日益成熟的分析技术（qPCR和NGS）能够更便捷更准确完成血液微生物的检测。目前在各大杂志发表的文献中，高通量测序的方式（如16S rDNA测序、宏基因组测序以及适合低微生物生物量测序的5R 16S测序）正是血液微生物检测相对主流的方式，但是相比于常规的16S测序和宏基因组测序，由于技术条件的限制，更加推荐5R 16S测序研究血液微生物组课题。主要有以下原因：①相比于血液中来自宿主的DNA，cmDNA的含量是极低的。尽管常规的16S测序（如V3-V4）可以用于cmDNA的检测，但是对于低微生物生物量的样本，它的检测灵敏度较低，检出率一般，使得血液微生物组的研究受限。②cmDNA易受到宿主DNA的干扰，利用宏基因组测序获得的菌群数据非常少，也不利于血液微生物组的全面挖掘。③采样端、实验端和测序端环境的污染也会造成影响，因此实验去除污染菌尤为重要，需要排除来自环境、采样实验试剂和仪器等所带入的菌群污染。2019-2020年Eisenhofer R和Deborah Nejman等人分别细化污染菌去除流程（Eisenhofer R.,2019）和优化低微生物生物量样本检测技术（5R 16S测序）（Deborah Nejman.，2020），污染菌去除流程详情可见“做肿瘤微生物检测，这些实验设计你都知道吗？”。
那么什么是5R 16S测序技术？简单来说是对16S rRNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序（图3）。与V3V4区扩增策略相比，5R 16S测序技术可以扩增出的区域覆盖约68%的16S全长序列，根据我们近百个血液微生物组项目结果来看5R 16S测序可以大幅提高细菌物种检测的覆盖率和分辨率（种水平），并且特别适合于低生物量的微生物样本检测。随着血液微生物的研究不断深入，会有更多的血液微生物被列为重要的检测项目，在疾病中的诊断价值中都具有重要的价值。
图3 5R 16S扩增16S rRNA基因的5个区域
灰色的R1-R5表示5R 16S扩增的5个区域
标题：Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach
发表杂志：Nature
影响因子：43.07
实验分组：数据发现—33个癌种涉及10481例癌症患者的18116份样本
实验验证—前列腺癌、肺癌等100名患者及69名健康个体的血液样本
研究方法：（WGS和RNA-seq数据）机器学习模型
图1 实验流程图
图2 微生物图谱特征区分癌症类型
图3 机器学习模型区分肿瘤类型
作者在TCGA数据中汇总研究了33个癌种包括10481例癌症患者的18116个样本，以此确定癌症样本中微生物DNA特征。结果表明通过训练和测试的机器学习模型可以区分癌症类型以及癌症与正常组织，可以某种癌症类型与其他32种癌症类型区分开来，并能识别癌症患者和健康个体。
图3 使用血液微生物DNA进行癌症鉴别、分类的性能，以及作为癌症“液体”活检的诊断方法
为验证已测试的机器学习模型的真实效果，作者对包括前列腺癌、肺癌和黑色素瘤等100名患者及69名健康个体的血液进行了16S rDNA测序。结果发现通过血液中微生物DNA利用机器学习模型可以识别癌症与健康样本（包括癌症类型），识别肺癌患者具有86%的敏感度，并以81%的准确率区分前列腺癌和肺癌。
在多数癌症类型的组织和血液中存在独特的微生物DNA特征，通过建立的机器学习模型识别和区分不同癌症样本及癌症类型，并补充血液样本诊断和开发癌症早期筛查的重要性。
标题：Circulating bacterial signature is linked to metabolic disease and shifts with metabolic alleviation after bariatric surgery
发表杂志：Genome Medicine
影响因子：15.27
实验分组：24名T2D患者 VS 24名健康对照
研究方法：16S rRNA基因测序
图1 实验流程图
图2 血液细菌特征衍生的Mets分类指数
由于MetS状态与细菌组成显著相关，作者对属和门水平的丰度(20个门和314个属)采用随机森林建立分类指标(MetS-Igenus和MetS-Iphylum)。与宿主变量相关性最大的是MetS-Igenus，它与肥胖和胰岛素抵抗相关的人体测量标志物（如总脂肪量、腰围）呈正相关；与白细胞数量、炎症反应指标以及与肥胖和胰岛素抵抗（HOMA-IR）相关的代谢标志物呈正相关；MetS-Igenus进一步与血脂异常和高血压相关，与甘油三酯水平和抗高血压药物数量呈正相关，而与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关。MetS-Igenus和MetS-Iphylum均与细菌数量呈负相关(图2E-F)。
图3 减肥手术后T2D患者的血液细菌负荷变化
基线期时血液细菌负荷与细菌丰富度呈正相关(图3A)，与白细胞呈负相关(图3B)，基线期时T2D患者显示出较低的细菌数量(图3C)。减肥手术后3个月，血液细菌载量下降，但在手术后12个月显著增加(图3D)，评估相关生理指标与基线时的T2D状态无关。根据减肥效果，受试者被评为“良好应答者”和“不良应答者”，两者在基线时显示出相似的血液细菌载量(图3E)。另一方面，不良应答者的细菌多样性在3个月时出现短暂的显著下降，但在12个月恢复到基线水平，而良好应答者持续且显著地减少(图3F)。
图4 受试者微生物丰度差异
除血液细菌负荷随时间的变化外，整个队列的菌属发生了显著且相似的变化。比较在12个月和基线期时的细菌易位显示，大多数在减肥手术后3个月观察到的细菌在12个月仍有保留(图4A)。减肥手术后的T2D症状缓解与伯克霍氏菌（Burkholderiacae）、韦荣氏球菌（Veilonellaceae）、乳酸杆菌（Lactobacillaceae）比例显著降低及红杆菌（Rhodobacteraceae）和 Pseudomonales比例增高相关(图4B)。此外，减肥手术后变化的属与代谢控制密切相关（图4A-D）。良好应答者在所有时间点的链球菌（Streptococcaceae）、Burkholderiacae、 Rhodobacteraceae、芽孢杆菌（Bacillaceae）的丰度增加，在反应良好和经历T2D缓解的受试者中与良好健康代谢呈正相关(图4B-D)。最后，作者通过荧光原位杂交技术（CARD-FISH）进一步证实了减肥手术后血液中存在活细菌且减肥手术后细菌数量增加
该研究发现血液循环微生物特征能够反映代谢疾病及其在减肥手术后的改善情况，为深入探索健康和促进疾病发生发展奠定基础。
(1) 血液细菌特征与代谢健康有关，基于血液中检测到的菌门和菌属计算的评分可较准确地区分代谢综合征患者与非代谢综合征患者；
(2)T2D患者的血液细菌负荷降低，且健康相关菌属减少；
(3)减肥手术后的体重减轻和代谢改善与健康相关菌属的早期稳定增加相关；
更多研究案例解析见血液循环微生物特征与代谢疾病及其缓解相关 | 血液微生物组，血液循环微生物特征与减肥手术后的减重和代谢缓解相关 | 血液微生物组，更多内容请关注联川生物公众号，回复“微生物”进行了解。
1.Panaiotov, S. et al. (2018) Cultural isolation and characteristics of the blood microbiome of healthy individuals. Adv. Microbiol. 8, 406.
2.Velmurugan, G., Dinakaran, V., Rajendhran, J., & Swaminathan, K. (2020). Blood Microbiota and Circulating Microbial Metabolites in Diabetes and Cardiovascular Disease. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, 31(11), 835–847.
3.Whittle, E., Leonard, M. O., Harrison, R., et al. (2019). Multi-method characterization of the human circulating microbiome. Front. Microbiol. 9, 3266.
4.Castillo, D. J., Rifkin, R. F., Cowan, D. A., & Potgieter, M. (2019). The Healthy Human Blood Microbiome: Fact or Fiction?. Frontiers in cellular and infection microbiology, 9, 148.
5.Velmurugan, G., Dinakaran, V., Rajendhran, J., & Swaminathan, K. (2020). Blood Microbiota and Circulating Microbial Metabolites in Diabetes and Cardiovascular Disease. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, 31(11), 835–847.
6.Goraya, M. U., Li, R., Mannan, A., et al. (2022). Human circulating bacteria and dysbiosis in non-infectious diseases. Frontiers in cellular and infection microbiology, 12, 932702.
7.Potgieter, M. et al. (2015) The dormant blood microbiome in chronic, inflammatory diseases. FEMS Microbiol. Rev. 39, 567-591.
8.Goraya, M. U., Li, R., Mannan, A., et al. (2022). Human circulating bacteria and dysbiosis in non-infectious diseases. Frontiers in cellular and infection microbiology, 12, 932702.
9.Dominy, S. S., Lynch, C., Ermini, F., Benedyk, M., Marczyk, A., Konradi, A., et al. (2019). Porphyromonas gingivalis in alzheimer’s disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. Sci. Adv. 5, eaau3333.
10.Poore G D, Kopylova E, ZhuQ, et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnosticapproach[J]. Nature, 2020: 1-8.
11.Zaidi AH, Pratama MY, Omstead AN, et al. A blood-based circulating microbial metagenomic panel for early diagnosis and prognosis of oesophageal adenocarcinoma [published online ahead of print, 2022 Sep 12. Br J Cancer. 2022;10.1038/s41416-022-01974-5.
12.Yiwei Q , Xiaodong Y , Shaoqing X , et al. Detection of Microbial 16S rRNA Gene in the Blood of Patients With Parkinson's Disease[J]. Frontiers in Aging Neuroscience, 2018, 10:156-.
13.Yan G , Liu J , Chen W , et al. Metagenomic Next-Generation Sequencing of Bloodstream Microbial Cell-Free Nucleic Acid in Children With Suspected Sepsis in Pediatric Intensive Care Unit[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology, 11:665226.
14.Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C, et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. Trends Microbiol. 2019 Feb;27(2):105-117.
15.Deborah Nejman,Ilana Livyatan,Garold Fuks,The human tumor microbiome is composed of tumor type–specific intracellular bacteria[J]. Science, 368.
所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由