好消息来啦！！！联川生物FFPE空间转录组测序闪亮登场

FFPE是生物学尤其是医学领域常见的组织保存形式，但是这一保存方式存在着DNA/RNA 降解的情况，导致FFPE样本的检测手段非常受限。基于此，联川生物空间转录组测序平台再添一利器之Visium FFPE，且10x Visium CytAssist 也已完成装机，并正式投入运行。接下来让我们一起来探索FFPE空间转录组测序的魅力所在吧！

1空间转录组技术

随着高通量测序技术的不断发展，空间转录组测序技术越来越受到科研人员的关注，发文量逐年提高，其中不乏CNS级别的文章（相关文献解读：深度剖析！为什么做空间转录组可以发CNS? | 空间转录组专题），未来空间转录组测序的爆发潜力巨大。且随着研究的深入，空间转录组测序技术不断突破研究壁垒，Visium FFPE就是其中之一，将组织学技术的优势与RNA测序的高通量和发现能力融入FFPE组织样本中，可对传统低通量的空间组织病理学分析进行补充（相关文献解读：Immunity：FFPE空间转录组揭示肾细胞癌异质性| 空间转录组专题）。

2FFPE空间转录组测序流程

• 1、样本准备：将FFPE组织切片放置在Visium基因表达玻片上，并进行组织学成像（通过H&E染色获得形态背景）；

• 2、探针杂交：Visium FFPE 玻片上的每个捕获区都有一个阵列，其中含有与RNA结合的捕获探针（RTL）。RTL有两段组成分别是LHS(左端探针)和RHS（右端探针）。左端探针有read 2结构，右端探针有polyA结构。探针杂交后，mRNA的两段连续探针只有同时被杂交之后才会进行连接，若只有其中一段被捕获，则无法进行建库，显著降低假阳性结果，RTL探针组确保了高特异性和高灵敏度；

  左端探针 (LHS）：Read 2S（提供扩增引物的结合位点） + 与mRNA互补配对序列

  右端探针 (RHS）：PolyA（与捕获序列的poly(dT)结合） + 与mRNA互补配对的序列

• 3、组织透化及文库构建：对组织进行透化处理，以释放连接的探针对，使其与玻片上的捕获探针（UMI和Barcode）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，从而制备测序文库；

• 4、数据可视化：通过特有的分析软件将空间层面的基因表达结果和形态学的结果结合在一起，进行可视化展示；

标准的Visium FFPE流程 VS Visium CytAssist的FFPE流程

2.1FFPE空间转录组优势

• 采用双探针结合的方式，有效提高了样本检测的高灵敏度和高特异性；

• 可以对长期保存的生物库样本进行重新分析，此外还可以开展大量的回顾性研究，追踪相应的生物过程；

• 可与其他的生物学实验相结合来观察基因表达和形态背景；

• 可针对整张FFPE组织切片进行探究，全面解析样本中重要的生物学信息；

3空间转录组应用场景

10x Genomics空间转录组测序以覆盖物种全面，突破空间障碍，解锁FFPE样本空间基因表达为优势，联川生物在空间转录组测序平台上样本处理经验丰富，并优先引入最新的空间转录组测序技术及仪器并进行了内测，下面是针对10x Genomics空间转录组测序技术的应用场景进行了总结：

4空间转录组测序新宠--10x Visium CytAssist

全新的Visium CytAssist是一款小巧的台式仪器，能够将FFPE组织切片上的转录组和蛋白质分析物从标准的组织学载玻片转移到Visium玻片上,实现组织切片的空间多组学分析。

4.110x Visium CytAssist技术优势

• 将转录组和蛋白质组分析物从标准载玻片自动转移到Visium玻片的捕获区域，简化样本处理；

• 无需在Visium玻片上直接切片，将样本兼容性扩展到贴有切片的载玻片；

• 通过标准的组织学技术预先筛选组织切片，选择出最有生物学意义的切片，从而最大限度地获得Visium实验的见解；

• 使用CytAssist专用玻片和试剂，每次运行可从最多两张FFPE组织切片中精确捕获分析物，而时间不到一小时；

• 人DV200的质控要求降为>30%，允许检测更多长期保存的高度降解的样本，样本兼容性更高；

• 新增加了大面积11mm * 11mm捕获区域，捕获面积更大，可能性更多；

• 三对探针对捕获，基因检出效率大大增加；

• 更高的组织粘附性，无需进行复杂的预实验。

4.210x Visium CytAssist测序流程

(1) 首先，在普通玻片上进行 FFPE 组织切片的脱蜡、染色成像、解交联和探针杂交等过程；

(2) 其次，将两个普通玻片和一张含有2个捕获区域（6.5mm* 6.5mm/11mm *11mm）的基因表达芯片放入仪器中，并将普通玻片上的组织切片与 2 个捕获区域对齐，并通过 Visium CytAssist 仪器捕捉明场图像，确定感兴趣的病理区域；

(3) 然后，通过运行Visium CytAssist将普通玻片上的转录组信息（选定目标区域的探针）原位转移到Visium捕获区域，Visium 捕获区域通过带有不同位置标签的探针获取所研究区域的转录组信息（探针释放和捕获），从而获取石蜡切片不同空间位置的转录本的表达水平；

(4) 最后，把10x基因表达芯片从仪器中取出，进行探针延伸及文库构建，然后进行上机测序和数据可视化展示。

Visium CytAssist内部结构

Visium CytAssist工作流程及原理

4.310x Visium CytAssist适用样本类型

• 石蜡包埋的样本；

• 已经保存在普通玻片上的FFPE样本；

• 贴在普通的玻片上的FFPE样本，通过H&E染色或者免疫荧光染色，选取感兴趣的切片，然后再将感兴趣的切片转移到Visium芯片上，解决选片困扰；

• 选取切片的一部分区域转移到Visium芯片上。

5送样要求

• 1. 整个石蜡包埋的样本：

  样本具有一定的厚度（实际实验过程中需要的切片数：10µm质控切片：2-4片；5µm H＆E染色选片：5-10片；5µm正式试验：1-2片）；常温/4℃封装完全寄送至联川生物实验室

• 2. 石蜡包埋的白片和贴片

  RNA质检：切片厚度为10µm；

  ① 组织较小：≤6.5 x 6.5mm：~4片切片

  ② 组织较大：≥6.5 x 6.5 mm：1-2片切片

  基因表达切片：切片厚度为5µm；

• 3. 已保存的玻片

  玻片推荐型号及有效区域如下所示；

  需要有满足刮取部分样本进行质检的样本或区域；

  基因表达切片：切片厚度为5µm；

  玻片保存在玻片盒中，常温/4℃寄送至联川生物实验室；

  推荐玻片型号及有效区域

10x Genomics官方推荐玻片有效区域

10x Genomics官方推荐玻片型号

Tips：玻片的常规尺寸在25mm*75mm，但是玻片太大或者太小均会导致玻片无法与CytAssist匹配，故目前CytAssist兼容组织玻片尺寸为：

• 宽度：24.80mm-25.29mm

• 长度：74.40mm-76.22mm

6CytAssist技术原理及操作官方视频

10x Genomics CytAssist操作指南官方视频

10x Genomics CytAssist技术原理官方视频

关于联川

杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。空间转录组测序作为联川战略发展方向，目前已经搭建针对新鲜组织样本和FFPE样本的空间转录组测序平台，有着丰富的样本处理经验，且能充分发挥自身优势，为客户提供最优质的服务。目前已经与多个科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系。

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