m6A促进水稻雄性减数分裂所需生长素的生物合成 | m6A专题
文章标题：RNA N6-methyladenosine modification promotes auxin biosynthesis required for male meiosis in rice
发表期刊：Developmental Cell
影响因子：13.417
作者单位：新加坡国立大学
发表时间：2022
一、研究背景
m6A是真核生物mRNA上最丰富的内部修饰，它影响mRNA代谢的多个方面，从而影响植物的各种发育过程和胁迫反应。相关研究表明，m6A在不同类型细胞或不同发育环境中的分布模式不同，这意味着m6A修饰是动态调控的，发生在特定的mRNA序列上。然而，m6A的靶标特异性的机制目前尚不清楚。
成功的雄性生殖发育包括几个重要的细胞事件，包括雄性器官（花药）内的减数分裂。在减数分裂过程中，二倍体亲本细胞（小孢子母细胞）产生单倍体细胞（小孢子），并经过两轮有丝分裂后进一步发育为花粉粒。因此，雄性减数分裂导致了从母体孢子体向雄性配子体的基本过渡，并在几代间重组了遗传信息。这一关键转变的显著特点是在拟南芥和水稻花药中的局部生长素最大值。虽然生长素在花药发育的连续阶段，包括减数分裂前、减数分裂和减数分裂后的发育中持续发挥重要作用，但当小孢子母细胞进行减数分裂时，其内源性水平在花药中达到峰值，这意味着生长素水平的上调可能与雄性减数分裂密切相关。在拟南芥中，生长素的生物合成对于减数分裂前花药发育过程中从花药裂片内层启动和规范雄性生殖细胞至关重要，生长素的分布高度集中在准备减数分裂的小孢子母细胞中。虽然这些研究表明，在小孢子母细胞减数分裂之前和分裂期间，花药中的生长素水平应该稳定上调，但如何达到局部生长素最大值来影响雄性减数分裂尚不清楚。
二、研究结论
1：OsFIP37突变体在水稻中表现出雄性减数分裂缺陷
作者利用CRISPR/cas9介导的靶标诱变技术对日本晴品系中的m6A writer复合物（包括OsFIP37）在内的蛋白进行了定向诱变。作者设计了2段sgRNAs靶向敲除OsFIP37通过对来自T1杂合子突变体的T2群体的目标基因组区域进行测序，一共鉴定到两个没有CRISPR/Cas9转基因的纯合子突变体，Osfip37-1和Osfip37-2，它们分别包含一个1-bp的腺嘌呤（A）插入和胞嘧啶（C）缺失（图1A）。对这些突变体中OsFIP37的6个最可能的脱靶位点进行进一步检测，发现推测的脱靶位点没有意外突变，表明CRISPR/Cas9对OsFIP37进行了可靠和精确的突变。
Osfip37-1与野生型植株的互交授粉结果表明，所有野生型胚珠都不能与Osfip37-1的花粉粒受精，而大多数Osfip37-1的胚珠都能与野生型花粉粒正常受精，这表明Osfip37结实率不高可能是由于花粉粒缺陷造成的（图1B）。Osfip37的正常花粉率和花粉萌发率显著降低。作者对花药发育进行了监测，发现当野生型植物花药发育进入第7期时，Osfip37-1和Osfip37-2明显产生更小、淡黄色、萎缩的花药（图1C）。
与野生型花药相比，在第5阶段的生孢细胞分裂和第6阶段的小孢子母细胞（或减数细胞）的生成过程中，Osfip37与野生型花药相比没有明显的细胞形态变化（图1D）。然而，在花药第7阶段，野生型植物减数细胞开始减数分裂，形状和大小不规则的异常减数分裂细胞以及绒毡层部分不规则（图1D）。
Osfip37中这些异常减数分裂细胞随后崩溃，在花药阶段8和阶段9没有形成二分体细胞、四分体或小孢子（图1D）。在第10阶段，Osfip37的花药房中只包含一些密集染色的残余物，并且缺乏空泡化的圆形小孢子。后续一系列观察结果表明，OsFIP37的突变与小孢子发生过程中小孢子母细胞减数分裂的消失有关。
由于OsFIP37对雄性减数分裂的影响比其先前报道的主要在小孢子退化中的作用要早得多。进一步，作者将gOsFIP37-3FLAG的基因组构建转化为Osfip37-1/+愈伤组织后检测发现，Osfip37-1的结实率和花药发育基本得到了改善，表明Osfip37-1的雄性不育表型是由于OsFIP37功能的丧失。
其次，通过利用RNA干扰（RNAi）创建了20多个OsFIP37敲低转基因植物，其中14个表现出与OsFIP37相似的生长缺陷，包括在第7阶段产生淡黄色和萎缩花药，以及正常花粉粒率的降低。这些表型与OsFIP37的下调相关。相反，过表达的OsFIP37并没有表现出明显的生长缺陷，这意味着OsFIP37的过度表达可能不会影响水稻的发育。这些结果表明，OsFIP37的缺失导致了雄性减数分裂的缺陷和由此导致的雄性不育。
为了检测OsFIP37是否影响雄性减数分裂与其在m6A mRNA甲基转移酶复合物中的潜在作用有关，作者比较了在第7阶段和第8阶段从野生型和OsFIP37花药中提取的mRNA的整体m6A水平。Dot blot分析显示Osfip37花药中m6A水平显著降低（图1E）。通过LC-MS / MS对m6A水平的定量测定进一步表明，OsFIP37 -1和OsFIP37 -2的总m6A水平显著降低至野生型花药的33%左右（图1F），表明OsFIP37是调控小孢子发生过程中对m6A修饰的必要条件。
图1：OsFIP37的突变导致水稻小孢子母细胞的减数分裂消失
2：OsFIP37在花药中高表达
作者对各种组织进行实时荧光定量PCR分析后发现，OsFIP37 mRNA在所有水稻组织中均有表达，其中在花药中表达量最高，而在发育中的花药中的表达量在第6~10期逐渐增加，之后逐渐下降（图2A）。
此外，作者还创建了OsFIP37：GUS报告基因系。与定量PCR结果一致，第6阶段后花药中GUS信号逐渐增加，第10阶段强度最强，之后成熟花药和花粉粒中信号保持较高（图2B）。在其他组织中也观察到GUS信号，包括柱头、发育中的胚胎、叶片和根。原位杂交同样显示，小孢子母细胞在第6阶段的小孢子母细胞、第7阶段的减数分裂细胞、第8阶段的四分体以及这些阶段的绒毡层细胞中，OsFIP37的表达增加（图2C）。
此外，在Osfip37-1 gOsFIP37-3FLAG发育过程中的6-10阶段，OsFIP37-3FLAG水平升高。因此，当雄性在花药第6期后发生雄性减数分裂时，OsFIP37的mRNA和蛋白的表达水平均表达上调。
然后，作者在一个建立的Osfip37-1 gOsFIP37-GFP系中检测了OsFIP37的亚细胞定位，在该系中，OsFIP37- GFP改善了Osfip37-1的雄性不育表型。共聚焦显微镜分析仅在根细胞核中检测到OsFIP37-GFP信号（图2D）。
图2：OsFIP37的表达模式
3：OsFIP37促进与m6A修饰相关的OsYUCCA3的表达
先前的研究表明，生长素在调节雄性生殖器官中起关键作用，在小孢子母细胞减数分裂过程中，在拟南芥和水稻花药中生长素丰度均为最大。
此外，在测量的四种植物激素中，只有Osfip37-1中游离白藜芦醇-3-乙酸的天然活性生长素（IAA）水平显著降低。这些发现促使作者研究OsFIP37的活性是否与花药发育过程中的生长素水平有关。
与之前的研究一致，野生型花药的IAA水平在第6期后显著升高，并在第7期和第8期左右达到最大值（图3A）。相比之下，在第6期后，Osfip37-1花药中的IAA水平显著降低，而在Osfip37-1 gOsFIP37-3FLAG中的IAA水平完全恢复（图3A）。第6阶段后Osfip37-1和野生型花药之间IAA水平的显著变化与Osfip37-1与野生型生长素的生长素分布模式一致（图3B）。这些结果表明，OsFIP37对花药中的生长素水平有促进作用，特别是在第6阶段之后。
图3：Osfip37-1中OsYUCCA3的下调与m6A的缺失
为了确定OsFIP37在生长素通路中的直接靶点，作者检测了OsFIP37是否影响参与生长素生物合成、信号转导、偶联和降解的基因。黄素单加氧酶家族编码的吲哚-3-丙酮酸途径中的限速酶，主要参与游离IAA的生物合成，因此作者首先研究了OsFIP37是否通过调节水稻花药中14个OsYUCCA基因的表达来影响生长素水平。结果表明在第7阶段和第8阶段，Osfip37-1花药中只有OsYUCCA3的表达显著下调。一项详细的研究显示，OsYUCCA3在Osfip37-1花药中特异性下调，但在Osfip37-1 gOsFIP37-3FLAG花药中恢复到野生型水平（图3C）。原位杂交同样显示，OsYUCCA3在第6阶段后的花药中表达，包括野生型花药在第7阶段进行减数分裂的减数细胞和第8阶段的四分体，而在含有第6期退化减数分裂细胞的Osfip37-1花药中，其表达明显降低（图3D）。此外，在检测的不同OsFIP37 RNAi细胞系中，观察到OsFIP37表达降低与OsYUCCA3表达下调之间的相关性。总之，这些发现表明，OsFIP37正向调控花药中OsYUCCA3的表达，特别是在第6期之后。
为了检测OsFIP37对OsYUCCA3的影响是否与OsFIP37介导的m6A甲基化有关，作者使用第7和第8阶段花药中提取的RNA进行m6A-IP qPCR，发现野生型花药的OsYUCCA3 mRNA在3，UTR处存在m6A修饰，而Osfip37-1中并无m6A修饰（图3E）。
此外，Osfip37-1 gOsFIP37-3FLAG花药的RIP-qPCR分析显示，在第6期后的花药中，OsFIP37-3FLAG与OsYUCCA3转录本相关（图3F和3G）。这些结果表明，OsFIP37与OsYUCCA3转录本相互作用，并介导它们在花药中的m6A甲基化，特别是在雄性减数分裂发生时。
除了YUCCA家族的基因外，作者还检测了OsFIP37是否会影响其他参与生长素的生物合成、信号转导、偶联和降解的基因。尽管在第7阶段和第8阶段，与野生型花药相比，这些基因的表达水平发生了变化，但m6A-IP-qPCR分析显示，这些基因在野生型或Osfip37-1花药中都没有被m6A修饰。同样，在雄性减数分裂过程中，RIP检测没有检测到OsFIP37-3FLAG花药中OsFIP37-3FLAG与这些转录本的结合，这意味着这些基因不太可能是OsFIP37在花药第7和8阶段的直接靶点。综上所述，该研究结果表明，Osfip37的雄性减数分裂缺陷与第6期后OsYUCCA3转录本的下调和它们在花药中受损的m6A修饰有关。
图4：Osfip37-1中OsYUCCA3的下调与m6A的缺失
4：OsFIP37与水稻花药中的OsFAP1相互作用
作者采用GST pull-down鉴定了花药中OsFIP37的相互作用蛋白。利用重组GST-OsFIP37蛋白在野生型花药的核蛋白提取物中提取其相互作用的蛋白。作者鉴定了一个肽（aaypsvek），位于一个假定的RNA结合蛋白（LOC_Os08g39440）中，其C端有一个RNA识别基蛋白（RRM）。通过将这个未知的蛋白命名为osfip37相关蛋白1（OsFAP1）。OsFAP1及其在其他植物物种中的同源物具有较高的序列相似性，特别是在RRM结构域。与OsFIP37一样，OsFAP1在花药中高表达。此外，作者还创建了一个OsFAP1：GUS报告基因，其中GUS基因融合在OsFAP1上游2.3kb5，序列的下游。大部分OsFAP1：GUS报告系显示，GUS信号在雄性减数分裂的花药中明显（图4A），在花药后期和花粉粒中保持较高信号。原位杂交进一步揭示了OsFAP1在6-8阶段的花药中的表达，包括小孢子母细胞、正在进行减数分裂的减数细胞和四分体。
由于OsFAP1和OsFIP37在花药中具有相似的基因表达模式，因此作者通过使用不同的方法证实了它们之间的蛋白相互作用。酵母双杂交试验证实了OsFAP1和OsFIP37之间的相互作用（图4B）。Pulldown实验进一步表明，MBP-OsFAP1与GST-OsFIP37相互作用，但与GST本身无相互作用关系（图4C）。除了类似的N. benthamiana叶表皮细胞中OsFAP1-GFP（图4D）和OsFIP37-GFP（图S3I）的核定位外，双分子荧光互补（BiFC）分析还显示了在N. benthamiana细胞的细胞核中OsFIP37和OsFAP1之间的直接相互作用（图4E）。更重要的是，使用特异性抗OsFAP1抗体对OsFIP37-1gOsFIP37-3抗体的蛋白提取物进行免疫共沉淀分析，证实了OsFAP1和OsFIP37在水稻花药中的体内相互作用（图4F）。
图5：OsFIP37与OsFAP1相互作用
5：OsFAP1是osfip37介导的OsYUCCA3的m6A修饰的必要条件
为了探索OsFIP37和OsFAP1之间的相互作用是否有助于OsFIP37对雄性生殖发育的影响，作者创建了两个OsFAP1突变体OsFAP1 -1和OsFAP1 -2，它们分别包含一个胞嘧啶（C）和一个腺嘌呤（A）插入，分别位于OsFAP1的翻译起始位点后（图5A）。这两个突变体在它们假定的脱靶过程中都没有发生意外的突变。与Osfip37突变体侧根短、分蘖少不同，Osfap1突变体在幼苗发育过程中没有表现出明显的生长缺陷。
然而，对生殖阶段Osfap1表型的详细观察显示，与Osfip37相似的微孢子发生缺陷，包括第7阶段较小的淡黄色花药（图5B），以及从第7阶段开始相关的异常和塌陷的减数分裂细胞（图5C）。结果表明，Osfap1突变体的定结实率明显低于野生型植物（图5D）。基因组结构gOsFAP1-3标志包含4.4 kb OsFAP1基因组区域包括2.3kb的上游序列和2.1kb的编码序列与3FLAG标签融合极大改善了Osfap1-2的缺陷花药表型，证实了Osfap1-2表型是由于OsFAP1功能的丧失。同样，在雄性减数分裂过程中，OsFAP1 RNAi敲除的转基因植株表现出结实率减少和花药发育缺陷。这些观察结果表明，OsFAP1和OsFIP37同样影响水稻雄性减数分裂和微孢子发生。
为了评估OsFAP1是否与OsFIP37相互作用，通过调节m6A修饰和OsYUCCA3来影响雄性生殖发育，作者还检测了OsFAP1突变体中m6A水平和OsYUCCA3的表达。Dot blot分析显示，在第7和第8阶段，从Osfap1花药中提取的mRNA中m6A水平降低（图5E），而OsYUCCA3在这些花药中的表达也下调。此外，m6A-IP-qPCR显示，在Osfip1-2中，OsYUCCA3上几乎不存在m6A修饰（图5F）。在Osfap1和Osfip37突变体中，OsYUCCA3表达及其m6A水平的这些类似变化均表明，Osfap1和Osfip37共同介导了OsYUCCA3的m6A甲基化及其转录水平。
进一步，作者使用含有保守的m6A修饰的OsYUCCA3 P6 RNA探针，通过RNA pull-down实验，进一步检测OsFAP1和OsFIP37是否与OsYUCCA3 mRNA结合，RRACH和m6A被OsFIP37和OsFAP1修饰（图3E和5F）。值得注意的是，只有GST-OsFAP1与GST-OsFIP37或GST没有，与OsYUCCA3 RNA探针结合（图5G）。这一结果，再加上在水稻花药体内观察到OsFAP1与OsYUCCA3转录本的关联（图5H和S6F），促使作者研究OsFIP37是否通过OsFAP1被招募到OsYUCCA3 mRNA中。为此，通过RIP-qPCR检测，使用特异性抗OsFIP37抗体检测野生型和Osfap1-2花药中FIP37与OsYUCCA3 mRNA的关联。这与第6阶段后Osfip37-1 gOsFIP37- 3FLAG花药中OsFIP37- 3FLAG与OsYUCCA3转录本的关联一致，在第6期后，在野生型花药中，OsFIP37与OsYUCCA3的关联相似，而这种关联在OsFIP1-2花药中被完全消除（图3G和5I）。这一发现与Osfap1-2花药在第7和第8阶段对OsYUCCA3的m6A修饰被取消相一致，表明在雄性减数分裂过程中，OsFAP1是OsFIP37介导对OsYUCCA3的m6A修饰所必需的。OsYUCCA3 RNA探针中保守的m6A修饰RRACH的突变并没有影响GST-OsFAP1的结合，这意味着OsFAP1与OsYUCCA3的结合不太可能依赖于OsYUCCA3的m6A修饰。
图6：OsFAP1影响微孢子发生，并直接与OsYUCCA3结合
6：OsYUCCA3影响Osfip37-1和Osfap1-2的雄性减数分裂缺陷
为了验证OsYUCCA3在OsFIP37和OsFAP1下游的微孢子发生过程中影响雄性减数分裂，作者在Nipponbare品种背景中生成了两个OsYUCCA3突变体，Osyucca3-1和Osyucca3-2，携带胸腺嘧啶（T）插入和腺嘌呤（A）缺失。这两个突变体在其假定的脱靶中没有发生意外突变，并且表现出与Osfip37和Osfap1突变体相似的减数分裂缺陷，包括花药发育缺陷和7期后减数分裂细胞塌陷，以及由此导致的花粉颗粒异常和结实率降低（图6A-D）。进一步作者将OsYUCCA3- 1愈伤组织转化为gOsYUCCA3- 3FLAG基因组结构，该基因组结构包含6.2 kb OsYUCCA3基因组区域，包括3.3 kb上游序列和整个2.9 kb编码序列与3FLAG标签融合。gOsYUCCA3- 3FLAG在很大程度上改善了OsYUCCA3-1中减数分裂细胞塌陷和花药发育缺陷，这表明OsYUCCA3的缺失导致了OsYUCCA3-1的减数分裂缺陷。
在Nipponbare品种背景下进一步获得了35S：OsYUCCA3转基因植株。与野生型植株相比，大多数株系的冠根数量略有增加，精根较短，分蘖较少，这与中华11号品种背景下35S：OsYUCCA3的表型一致。虽然在35S：OsYUCCA3基因株系中没有明显的花药缺陷，但在第7期和第8期花药中OsYUCCA3的表达明显上调。然后作者选择了35S: OsYUCCA3（#4），显示OsYUCCA3在花药7期和8期的最高表达，与Osfip37-1和Osfap1-2杂交。与预期的一样，OsYUCCA3的过表达部分改善了Osfip37-1和Osfap1-2的花药和减数分裂缺陷（图6B和6C）。结果表明，Osfip37-1 35S：OsYUCCA3和Osfap1-2 35S：OsYUCCA3产生了更多的正常花粉粒，并且分别比Osfip37-1和Osfap1-2具有更高的定籽率（图6D）。这些观察结果证实，OsFIP37和OsFAP1至少作用于OsYUCCA3，调节雄性减数分裂和微孢子发生，从而影响雄性的生育能力。
由于OsFIP37和OsFAP1介导了OsYUCCA3在其终止密码子附近的m6A修饰（图3E和5F），并且在第6阶段后的花药中OsYUCCA3的正常表达也是必需的（图3C），然后，通过测定转录抑制剂放线菌素D处理的野生型、OsFIP37 -1和OsFAP1 -2花药中m6A水平，来测试OsFIP37和OsFAP1对m6A的修饰是否影响OsYUCCA3 mRNA的稳定性。放线菌素D处理8-24 h后，osyucca 3在Osfip37-1和Osfap1-2中累积的RNA稳定性均较野生型花药显著降低（图7A）。相比之下，非m6A靶向转录本，如泛素（UBQ）和ACTIN，在不同遗传背景下的放线菌素D处理下表现出相似的RNA稳定性（图7A）。这些结果表明，在雄性减数分裂过程中，OsFIP37和OsFAP1调控OsYUCCA3上的m6A甲基化，促进其在花药中mRNA的稳定性。
图6：osfap1依赖的m6A甲基化促进了水稻雄性减数分裂所需的生长素的生物合成
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