温故知新：空间转录组——简单的研究方法带来不简单的研究成果

参考来源

Piñeiro AJ, Houser AE, Ji AL. Research Techniques Made Simple: Spatial Transcriptomics.J Invest Dermatol.2022;142(4):993-1001.e1. doi:10.1016/j.jid.2021.12.014

基于组织和单细胞的转录组测序可分析在不同生物环境事件中发生的基因表达变化。但在组织提取或者单细胞组织解离过程中，空间信息将大量丢失。原位技术与单细胞研究技术的结合，创造性产生了空间转录组学技术，将保留RNA分子的原位空间环境，能够在完整组织内定位细胞类型及其相关基因表达，进而揭示更多科学问题，比如由多种和不同的细胞类型组成的生态环境如何协调其整体行为。技术方法的革新带领研究场景从组织、细胞簇、单细胞、含有空间信息的单细胞依次递进。

01
空间转录组技术类型

空间转录组技术迄今为止包括原位杂交 (ISH)、原位测序 (ISS) 和原位捕获 (ISC) 技术（如图所示）。其中ISH和ISS是针对特定基因的检测技术，优势是具有选择性的高效捕获效率，不足是检测通量较小，通常是几百个基因。ISC是采用无偏好捕获转录本并基于NGS方法获得全转录组信息，优势是检测通量高，依次可以捕获数千个基因，同时对应的劣势是捕获效率相对较低，即任何基因的一部分RNA均会被捕获检测，平摊同一有限的测序数据。因此，每种方法都有自己的优点和缺点以及对应的分辨率。该分辨率指的是为特定转录本位置的精确程度，可以从定位亚细胞水平到定位55 μm直径的x-y空间坐标。亚细胞分辨率可定位到单个细胞内的转录本，甚至在亚细胞室内，如细胞质或细胞核；但需要了解的是，捕获点位仍大于一个典型细胞的直径（约10 μm），因此检测位可能包含几个细胞，而混淆具体是哪个细胞在表达转录。

图1、空间转录组技术路线

In situ hybridization (ISH)

原位杂交方法，采用荧光基团标记的探针来检测特定目标基因。针对短转录本序列进行探针的设计合成，与目标经过连续的杂交、成像、探针清洗等步骤。典型代表是seqFISH技术方法。ISH 技术使研究人员能够在其天然环境中直接观察 RNA 分子，而不需要从组织中提取细胞并进行非原位分析。直接可视化是通过杂交与预先确定的目标 RNA 目标互补的荧光标记探针实现的。来自标记探针的信号用于确定空间环境中转录本的定量测量。这种方法可实现高的RNA捕获效率，达到单细胞/亚细胞分辨率的转录本检测，截至目前检测目标数量也在不断提升。但其明显的劣势是成本和操作工作量随着目标数量的增加将显著提升，并且需要借助特定设备；同时用于组织杂交的探针存在数量的上限限制。

图2、ISH技术

In situ sequencing (ISS)

原位测序方法，对目标基因的RNA或cDNA，通过标记了条形码的探针（挂锁式）进行杂交和连接反应，并进行多轮目标扩增和测序，以实现不同目标基因的空间检测。所描述的步骤特别遵循带有条形码挂锁探针方法的 ISS。典型代表是FISSEQ技术方法。ISS 技术通过荧光信号直接读出cDNA扩增子的碱基对信息。针对特定转录本的条形码使整个组织实现可视化。该等方法可实现亚细胞分辨率，与ISH相比拓展了检测范围，同时避免了逆转录 (RT) 步骤，进一步提高ISS的效率。但其显著劣势在于受到已知基因、及其小视野需求的限制，其并未在发明实验室以外进行拓展应用，提示其落地的难度。

图3、ISS技术

In situ capturing (ISC)

原位捕获方法，基于捕获点位，即在一张微阵列上连接一系列携带唯一位置标签的RT引物，以polyT捕获mRNA转录本。逆转录产物cDNA被提取出来进行高通量测序。位置条形码被映射到组织上的特定位置，并实现转录组的空间可视化，典型技术方法是10X Visium平台。

与ISH和ISS相比，ISC技术在原位捕获转录本，然后在异地完成测序，整合了原位杂交的空间定位优势和高通量测序的效率优势。有多种ISC方法，包括 10X Genomics Visium、Slide-seq和Seq-Scope等，在从组织切片捕获转录本的具体方法上有所不同。但一般是通过在一张载玻片上固定一系列RT引物，这些引物携带对应不同位置的核苷酸条形码，通过poly-T 序列进行mRNA杂交。具体来说，是将组织切片贴到载玻片上，经过固定、染色、成像和透化（Visium 和 Seq-Scope）或直接与带条形码的 RT引物（Slide-seq）杂交步骤完成原位捕获工作。其中，10X Visium平台在透化过程中，将来自组织的 mRNA 分子向下扩散并与RT引物杂交。RT反应后的cDNA制备成测序文库。测序完成后采用专用软件，通过转录组空间可视化的位置条形码将读数叠加回组织图像。Ståhl 等人2016 年用小鼠大脑和人类乳腺癌组织验证了他们的第一个ISC方法，后来发展成为商业化的 10X Visium技术，该技术缩小捕获点之间的距离，至55 μm的点直径以提高分辨率。捕获点直径直接限制了分辨率，本质上来说是载玻片上短链寡核苷酸（携带条形码标签）之间的间距限制。

图4、ISC技术

图5、ISC技术数据分析流程

02
不同空间转录组技术比较
03
空间转录组技术局限性空间转录组是单细胞RNA测序研究的有力技术手段，既能获得RNA信息，又可定位空间信息，使结果可视化。但与单细胞RNA测序相比，目前的空间转录组均存在从完整组织中检测转录本的深度和/或覆盖度不够理想的问题，通常表现为空间转录组数据中捕获的异质性低于单细胞RNA测序中的异质性；因此，将空间转录组与来自同一组织样本的单细胞转录组测序结合起来，对于解决某些生物学问题具有显著的协同优势。








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