肝细胞癌的肿瘤微生物组特征 | 肿瘤微生物

论文标题：The Intratumoral Bacterial Metataxonomic Signature of Hepatocellular Carcinoma

刊登日期：2022年09月

发表杂志：Microbiology Spectrum

影响因子：9.043

技术手段：16S rDNA测序

（一）研究背景

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症和第四大致死率最高的癌症，瘤内细菌可能与癌变有关，大多数瘤内细菌位于细胞内并且在癌细胞和免疫细胞中都有发现。瘤内细菌与肿瘤细胞的距离较近，形成的微环境可能与肝细胞癌的病理过程有关，但肝脏中活菌的存在和瘤内细菌的细胞分布仍然是已知的。

（二）研究思路

图1 研究思路

（三）研究内容
1、HCC组织的微生物的DNA富集于肝细胞和红细胞的细胞质中

图2 肝癌的FISH分析

为评估HCC中微生物DNA的分布和丰度，作者使用16S rRNA探针对癌组织及癌旁组织进行FISH实现，发现FISH信号分布于癌组织和癌旁组织，主要存在细胞质中；在癌旁组织中作者发现在释放最强信号的几个扩大的窦状区无核红细胞（RBC）中富集了FISH信号（红细胞在肝窦内的堆积表明受损肝组织严重充血）。

2、HCC组织中存在活菌和感染性细菌

图3 实验证明组织中存在细菌

为研究HCC组织是否存在活菌，作者收集术后新鲜HCC组织通过组培法检测活菌的情况，作者通过设置阳性对照和阴性对照分别在好氧与厌氧环境中进行实验，发现阳性对照中环境样本在好氧培养下产生了数千个菌落，而厌氧培养产生了30+可见菌群，阴性对照没有产生可见菌，表明组培法的可靠性是比较高的。作者通过对培养出来的菌群进行菌落PCR和16S rDNA测序，共鉴定出13个菌落，其中2个菌落为金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、8个菌落为罗氏菌属（Rothia）兼性厌氧菌，2个菌落为芽胞杆菌（Bacillaceae）的好氧菌，1个是属于棒状杆菌（Corynebacterium sp.）的嗜氧微细菌。以上结果表明HCC组织中含有活的瘤内细菌。

3、16S rDNA测序分析肿瘤组织菌群

图4 168个正常、肿瘤组织和HCC组织的16S rDNA测序。

作者通过16S rDNA测序分析肝癌组织微生物群的结构和丰度，检测了68对HCC和癌旁组织配对样本、29例正常肝组织和3例独立的肝癌组织。与正常肝组织相比，HCC中微生物群的α多样性显著增加，癌旁组织富集有变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota），而正常组织中副杆菌（Patescibacteria）和酸杆菌门（Acidobacteriota）丰度更高（图4A-D）；而HCC组织中显示出更高的Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteriota，而Patescibacteria和Acidobacteriota的丰度较低（图4E-F）。以上结果表明，与对照组相比HCC组织和癌旁组织具有相似的微生物特征，但是分析其他菌群发现变形菌（Gammaproteobacteria）在HCC组织显著富集而不在癌旁组织中显著富集。为了验证这一结果，作者通过qPCR对Gammaproteobacteria进行分析发现与测序结果一致，癌组织中的Gammaproteobacteria丰度显著高于正常组织（图4I-J）。LEfSe结果证实，与健康对照相比HCC组织Proteobacteria、 Firmicutes、 Actinobacteriota 增加，而Acidobacteriota、 分歧杆菌（Parcubacteria）、酸杆菌（Acidobacteriae）减少（图5C-D）；

图5 正常、癌旁和HCC组织中微生物的分布图

图6 LEfSe分析揭示组织样本中的特定类群

4、HCC肝硬化患者和HCC非肝硬化患者间丰度差异的细菌类群

图7 肝硬化肝细胞癌和无肝硬化肝细胞癌丰度差异的细菌类群

作者分析了28例肝硬化HCC患者和34例非肝硬化HCC患者之间丰度不同的细菌类群，发现肝硬化肝细胞癌中链球菌科（Streptococcaceae）和乳球菌（Lactococcus）显著高于非肝硬化肝细胞癌（图7A）；另一方面，肝硬化肝癌中疣状菌（Verrucomicrobiota）、黄单胞菌（Xanthomonadales）和结肠杆菌（Caulobacterales）等菌显著减少。通过LEfSe分析发现链球菌（Streptococcaceae）和乳球菌（Lactococcus）是HCC肝硬化的标志类群（图7B），与正常肝组织相比，Streptococcaceae和Lactococcus在HCC组织中显著富集（图7C）。

5、瘤内微生物组成与HCC患者的临床病理参数相关

图8 PICRUSt在不同肝脏微生物群中的功能

作者通过将在HCC组织发现的关键菌群与临床病理数据进行联合，Firmicutes的丰度与肝硬化炎症分级相关（x²=4.667，P=0.0308）；Actinobacteriota在女性患者中具有显著的患病率（x² = 6.6670，P = 0.0098），并与较大的肿瘤体积相关（x² = 5.1923，P = 0.0027）；酵母菌（Saccharimonadia）与肝硬化炎症分级（x² = 5.5100，P = 0.0189）和肿瘤体积（x² = 5.1923，P = 0.0227）相关；Lactococcus与肝硬化状态（x² = 6.7873，P = 0.0092）显著相关。以上结果表明提示瘤内微生物与HCC患者的临床病理特征相关。

作者使用PiCRUSt2推断肝脏微生物群的功能，分析MetaCyc代谢通路数据库显示，健康组和癌旁组之间以及健康组和肿瘤组之间分别有28条和16条功能通路发生了显著变化（图8A-B）。与健康组相比，肿瘤组织和癌旁组织的细菌棕榈酸盐生物合成途径均有所增加，而降低的菌群在能量生产和转换、氨基酸运输代谢、无机离子运输和代谢、细胞周期功能一致。相比之下，肿瘤组织和癌旁组织之间只有6个功能通路发生了改变，说明这两种微生物具有较高的相似性（图8C）。综上所述，不同肝微生物群的功能变化可能在肝癌的进展中发挥重要作用。

6、肝脏微生物特征可用于预测HCC

图9 基于微生物的HCC诊断性生物标志物

肿瘤内微生物特征可能有助于开发潜在的癌症诊断或预后生物标志物。为建立HCC患者诊断的临床指标，作者对40名HCC患者和21名正常受试者训练队伍的微生物特征构建了随机森林预测模型，该模型不仅在训练队伍中表现良好，而且在包含20个HCC患者和7名正常受试者的炎症队列中也表现良好（图7A）。另外，作者为简化模型微生物特征，采用10倍交叉验证对微生物特征进行优先排序，前5类物种包括杆菌（Bacilli）、Acidobacteriae、Parcubacteria、Saccharimonadia和Gammaproteobacteria（图9B-C）。简化的随机森林模型可以将训练队列中HCC患者与正产受试者区分开来，并通过验证队列中验证其性能良好，与所有微生物特征构建的模型相当（图7D-F）。

（四）研究小结

该研究通过16SrDNA测序分析了正常肝脏组织、癌旁组织和肿瘤组织的微生物特征，揭示了主要关键类群与HCC的临床特征之间的关联，并且通过训练队列和验证队列构建了一个高性能的机器学习预测模型用于潜在的HCC预测。

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