FAQ丨M20-seq技术原理、VITA产品详情及性能解答

FFPE（Formalin Fixed Paraffin Embedded）标本凭借着保存时间长、可关联临床及多组学数据等诸多优点，是医学病理和机制研究、药物发现和回顾性研究的宝贵资源。联川生物与M20 Genomics达成合作协议，共同推广新一代单细胞测序技术，深耕厚植FFPE样本单细胞研究的科研市场！

M20-seq技术及VITA系列单细胞全长转录组产品自去年发布后，已逐步面向市场开始应用。作为新一代单细胞测序技术，大家对M20 Genomics（简称M20）的核心技术与产品除了支持外还有很多实际应用的疑问。我们整理了近期咨询量较高的问题，希望能帮大家更了解M20的技术和产品。

QM20-seq技术原理是？
A: M20-seq技术基于随机引物原理，在细胞（核）/细菌内原位逆转录后进行单细菌标记及测序。M20-seq基于随机引物原理可对RNA分子全长进行无偏捕获，此外可以捕获包含lncRNA、CircleRNA在内的非编码RNA。因此，M20-seq技术可在单细胞水平展开更多维度的研究。

M20-seq原理

Q为什么M20-seq可以进行石蜡包埋样本，RNA降解样本、细菌样本的单细胞检测？

A:石蜡包埋样本，RNA降解样本均存在RNA降解情况。经典的mRNA降解通用模型中，Poly(A)尾变短（即脱腺苷化）时， poly(A)结合蛋白PABPC从mRNA上释放下来，mRNA随即被降解。而传统单细胞技术基于Poly(A)进行RNA捕获，因此对RNA完整度要求较高，对石蜡包埋样本，RNA降解样本效果较差。

而细菌RNA本身不具有 poly(A)结构，因此传统单细胞技术无法检测。

M20-seq技术基于随机引物原理，即使RNA分子有一定程度降解、没有poly(A)结构，仍可捕获RNA分子后进行细胞标记，因此可以进行石蜡包埋样本，RNA降解样本、细菌样本的单细胞检测。

M20-seq与基于poly(A)单细胞技术对比图

Q

基于M20-seq技术的VITA单细胞全长转录组平台包含哪几部分？

A: VITA单细胞全长转录组平台包含：VITAPilote系列试剂盒、VITACruiser单细胞制备仪和VITASeer软件，均为M20 Genomics自主研发。QVITA平台实验流程是？
A: 实验流程如下：

实验流程图

Q整个实验流程耗时如何，哪些步骤可以暂停实验？

A:从样本解离至文库构建完成时长约1.5-2.5天。

实验可暂停步骤：细胞核提取后、RNA逆转录后、cDNA延伸后、cDNA扩增后。

Q进行细胞（核）/细菌内原位逆转录，核酸物质会溢出胞（核）外吗？

A:为了实现原位逆转录，M20-seq需要对样本进行有效固定。4%多聚甲醛固定可终止了任何正在进行的生化反应，保存细胞内固有的物质，使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止内源性及外源性酶的反应，使细胞或组织基本上保持与活性状态时的物质一致。

甲醛可以与蛋白质的氨基及其他基团结合，当甲醛与2个分子结合使其靠得很近，就会交联形成“-CH2-”，称为亚甲基桥。交联的数量随着时间的推移而增加，形成空间网状结构。碳水化合物、脂类和核酸等物质被困在蛋白质交联成的网状结构中。核酸物质不会溢出细胞核。（点击查看固定原理）

Q不基于poly(A)捕获，如何进行单细胞标记？
A: 原位逆转录结束后，在cDNA末端加上捕获接头，捕获接头可与微珠上的oligo序列互补配对。配对后进行延伸使得cDNA链加上细胞标签，完成单细胞标记。

单细胞标记示意图

Q仪器设备的性能如何？

A:仪器设备性能详情如下：

• 细胞通量范围：1000-20000个细胞/通道（标准试剂盒）；

• 样本通量：4个通道；

• 细胞大小：无限制，细胞、细胞核均可；

• 细胞捕获率：50%~60%；

• 双胞率：每5000个细胞，低于2%；

• 上机时间：不超过10分钟；

• 适用样本类型：新鲜，冻存，石蜡包埋（FFPE）；

• 适用物种：真核生物（人、小鼠、大鼠、植物等），原核生物（细菌等）；

QVITA平台数据是否兼容其他单细胞分析软件？

A: 第一步需要使用VITAseer进行数据处理，后续兼容其他单细胞分析软件。

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关于M20 Genomics

M20 Genomics（简称“M20”）成立于2021年2月，是一家专注于单细胞产品及相关技术开发的生命科技公司，总部位于中国杭州。

M20主创成员来自国内外顶尖高校，长期从事单细胞测序及相关技术的研究和应用，在各自领域内拥有全球领先的科研和转化成果。公司自主研发的全球首个基于随机引物的全样本高通量单细胞测序产品 – VITA系列，突破性地实现了全样本类型、全物种和全长RNA的（超）高通量单细胞转录组测序。

M20立志打破壁垒，找到前行的力量，探索生命的本源，以新一代单细胞技术引领生命科技的发展。

关于联川

杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近百篇，影响因子平均15+。

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