单细胞多组学专题：人肺空间分辨图谱表征腺体相关的免疫生态位
期刊名：nature genetics
发表时间：2022
所用组学：单细胞转录组测序(Sc RNA seq)、单核转录组测序(Sn RNA seq)、空间转录组(ST RNA seq)
一、 背景
目前肺部疾病在全球死亡率中排名第三，全面了解肺功能的细胞及其微环境对减少肺部疾病非常重要。肺除了在气体交换中有主要作用外，还具有重要的屏障功能。虽然其他粘膜屏障组织通过粘膜相关淋巴组织(MALT)协调适应性免疫，但在健康人肺中尚未报道此类二级淋巴结构。由于目前的图谱优先考虑薄壁组织，鲜有研究气道。因此，在这里作者通过对已故器官捐献者的健康肺部和气道进行了深层组织分析，沿着呼吸树的近端到远端轴对细胞类型进行表征。在此文章中，作者区分了80种细胞类型和状态，其中包括11种在之前的肺图谱研究中未注释的细胞群。这些人群中的大多都表达功能性全基因组关联研究(fGWAS)分析中强调的疾病相关基因。作者通过将组织分析与空间基因组学相结合，以全分子宽度重建肺部和气道中已知的组织微环境。最后，作者在气道粘膜下腺(SMG)处确定了一个以前未定义的IgA浆细胞免疫生态位。
二、 实验设计
空间转录组测序： 从6名已故捐献者收集气管、第二代/第三代支气管、第四代支气管、左上叶实质和左下叶实质等五个肺部位置组织
单细胞免疫组测序：从5名已故器官捐献者收集气管、第二代/第三代支气管、第四代支气管、左上叶实质和左下叶实质等五个肺部位置组织
单核转录组测序：从7名已故器官捐献者收集气管、第二代/第三代支气管、第四代支气管、左上叶实质和左下叶实质等五个肺部位置组织
图1 实验设计
三、 研究结果
1、人类肺和气道的空间多组学图谱
作者将scRNA-seq和snRNA-seq、VDJ-seq和STRNA-seq应用于人的肺和气道五个位置的深层组织样本以获得软骨、肌肉和SMG等组织结构。总共有193108个细胞和细胞核被注释为：上皮细胞、免疫细胞、红细胞、内皮细胞和基质细胞五种细胞类型。根据共有标记基因和其他肺研究的命名对细胞进行注释，包括整合的 HLCA和lungMAP(图2b)
图2人肺和气道的空间多组学图谱
采用Visium ST对来自五个位置的20个组织切片进行探究，作者评估了不同组织微环境中细胞的空间分布，相应的细胞类型可以很好的映射到已知的空间位置上，例如纤毛上皮细胞映射到被基底细胞包围的气道腔区域，肺泡1型(AT1)和2型 (AT2)细胞映射到肺实质区域(图2c、d)。
2、具有免疫招募特性的罕见成纤维细胞
细胞再分群结果表明一共鉴定到了11种不同的成纤维细胞簇(图3a、b)。作者注释了先前描述的肌成纤维细胞、间皮细胞、外膜和肺泡成纤维细胞和七个新亚群，包括一种罕见的细胞类型，称为免疫招募成纤维细胞(IR-fibro)。IR-fibro表达趋化因子CCL19和CCL21以及成纤维网状细胞和滤泡树突状细胞(fDC)的其他标记基因，它们共同负责T细胞和B细胞在次级淋巴器官中的定位(图3c)。这些细胞被映射到支气管中罕见的免疫浸润中，并得到了smFISH的验证(图3d)。此文章中健康供体存在的免疫浸润与之前的研究一致。生发中心成纤维细胞的标记基因也映射到Visium ST捕获的免疫浸润中，这进一步表明IR-fibro与淋巴器官基质细胞的相似性。
总之，作者描述了一个可能在免疫细胞募集中发挥作用的IR-fibro。使用其新定义的标记基因，也可以在HLCA中检测到该亚群。
图3具有免疫募集特性的稀有成纤维细胞
3、支气管周围和软骨膜成纤维细胞
根据它们在气道上皮（peribronchial fibroblasts—PB-fibro）和软骨(perichondrial fibroblasts—PC-fibro)周围的特异性定位进行了注释，鉴定到两个在气道中富集的成纤维细胞群(图3b、e、g)。
fGWAS分析量化了细胞类型特异性基因和疾病相关SNP之间的系统关联，显示PB-fibros与FEV1/FVC比率测量的肺功能相关(图3f)。
PC-fibro与软骨细胞一样，在单核转录组测序中被鉴定到(图3b)。作者在人类蛋白质图谱 (HPA)中发现了软骨周围COL12A1的类似标记基因的表达，这支持PC-fibro的cell2location定位(图3g)。作者鉴定了骨骼发育基因LRG4/6以及PC-fibro中的成纤维细胞标记物，将它们作为中间细胞类型置于从外膜成纤维细胞到软骨细胞的轨迹中。此外，PC-fibro表达的基因（FLNB和FGFR2）是人类骨骼异常的原因之一，这表明PC-fibro在支持软骨功能和相关异常中的相关性。
图3具有免疫募集特性的稀有成纤维细胞
4、体循环和肺循环中的血管细胞类型
对于脉管系统，作者通过实质(肺脉管系统，发生气体交换的地方)和气管(全身脉管系统，为组织提供氧气)的特定富集来区分肺循环和全身循环(图4a、b)。作者还使用ST区分了不同组织位置的其他细胞类型：动脉内皮细胞(全身E-Art-syst和肺E-Art-pulm)、平滑肌细胞(非血管气道(ASM)、肺 (SM-pulm)和全身(SM-syst))和周细胞(Peri-pulm)、全身(Peri-syst)和静脉免疫募集(IR-Ven-Peri)；(图4a-f)。
在不同的组织位置使用ST，作者进一步区分了动脉内皮细胞类型(全身动脉内皮细胞(E-Art-syst)和肺动脉内皮细胞(E-Art-pulm) ）(图4a、c), 非血管性气道平滑肌细胞(ASM)，以及肺和全身平滑肌/血管周围细胞 (肺平滑肌(SM-pulm)和肺周细胞(Peri-pulm)), 全身动脉平滑肌(SM-Art-syst),全身周细胞(Peri-syst)和静脉血管周围细胞，即免疫募集血管周围细胞(IR-Ven-Peri) (图4a-c、f)。
IR-Ven-Peri表达ABCC9和ICAM1但不表达CSPG4，类似于毛细血管后静脉血管周围细胞，对于免疫细胞归巢至外周淋巴结很重要（图4d 、e)。IR-Ven-Peri表达趋化因子并与静脉内皮血管(ACKR1+)共定位(图4e)，并通过Visium ST(图4f)和smFISH显微镜(图4g)进行了验证。
总之，作者区分了体循环和肺循环的细胞，描述了新的IR-Ven-Peri细胞，并进一步定义了内皮细胞和血管周围细胞之间的关系(图4h)。
图4体循环和肺循环的细胞类型
5、气道SMG中导管细胞的鉴定
在上皮隔室中，作者鉴定了已知和罕见的细胞类型，并定义了人类 SMG导管细胞(图5a)，这些细胞在气管中富集并且以前仅在小鼠的单细胞水平中被表征。ALDH1A3、MIA和RARRES1的smFISH染色验证了SMG的定位并将这些细胞与其他上皮细胞区分开来(图5b)。
作者还在snRNA-seq中鉴定了肌上皮细胞，表达基底上皮(TP63和KRT14)和肌肉(ACTA2、TAGLN和CNN1阳性，但DES阴性)标记基因(图5a)，并定位在腺体周围。有趣的是，小鼠肌上皮细胞也被证明可以再生气道表面上皮细胞。然而，在人类中，肌上皮细胞的定义并不明确，这可能是由于难以分离这种细胞类型导致的。
总体而言，作者发现了SMG上皮细胞及其在人类SMG中的空间定位信息。
图5人气道中的 IgA 浆细胞与 SMG 共定位
6、肺和气道髓系细胞中的免疫细胞异质性
作者确定了所有主要的免疫细胞群(图5c)，这些Clusters被单独分析以揭示其异质性，尤其是在髓系细胞中。作者发现了已知的巨噬细胞亚群，包括血管内巨噬细胞(表达LYVE1和MAF) 、 CXC3CR +气道、CHIT1+ 和间质巨噬细胞。作者确定了一个以前未定义的表达单核细胞(CD14)和巨噬细胞标记物，称为宏观中间体（macro-intermediate）。在肺泡巨噬细胞中，又出现了以下两个簇：分裂细胞(Macro-alv-dividing）和表达金属硫蛋白的簇(Macro-alv-MT)，包括MT1G、MT1X和MT1F。金属硫蛋白在结合和代谢金属离子以及免疫和应激反应中发挥作用。最后，作者发现了一个罕见的未描述的巨噬细胞群，它们表达包括CXCL8、CCL4和CCL20趋化因子，作者将其命名为 Macro-CCL。CXCL8和CCL20的表达将该子集与表达CCL4的间质巨噬细胞区分开来。CXCL8与肺部感染、哮喘、IPF 和 COPD 相关并在银屑病皮肤巨噬细胞中被鉴定。
T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞包括CD4 T、CD8 T、MAIT、NK、NKT、先天淋巴样细胞及其亚群（图5c)。在CD4细胞中，作者区分了原始/中央记忆(CD4-naive/CM)、效应记忆/效应(CD4-EM/Effector)、调节性T细胞(Treg)和组织驻留记忆(CD4-TRM)细胞。在CD8细胞中，作者发现了γ-δT细胞(γδT)、TRM (CD8-TRM)和两个不同的簇，NK子集包括 NK-CD11d、 NK-CD16hi和NK-CD56 bright。CD11d+ NK细胞在小鼠和人类中响应感染而被激活，之前在人类血液中以及本文中首次在健康人肺中显示。
总的来说，作者以前所未有的分辨率定义了人类肺部和气道的免疫细胞。
图5人气道中的 IgA 浆细胞与 SMG 共定位
7、IgA浆细胞与SMG的共定位
B细胞包括幼稚和记忆B细胞、IgA和IgG浆细胞以及浆母细胞(图5c)。IgA对粘膜免疫很重要，它在气道样本中最常见，而在实质中仅排第三(图5d)。
在Visium ST数据中，IgA浆细胞映射到气道SMG中，与导管、粘液和浆液细胞共定位，而IgG映射到免疫浸润部位(图5e)。作者进一步区分了浆液腺中IgA浆细胞的富集，显示了两种不同的腺体因子，一种是SMG浆液细胞与IgA浆细胞共定位，另一种是与其他SMG上皮细胞共定位(图5f)。IgA浆细胞的这种优先定位通过在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)保存的组织样本上手动注释ST中的腺体区域得到证实，这可以更好地区分浆液腺和粘液腺。
图5人气道中的 IgA 浆细胞与 SMG 共定位
8、细胞-细胞相互作用和SMG免疫细胞生态位
为了在单细胞分辨率下剖析这个生态位，作者使用多重IHC来确认SMG中存在IgA2但不存在IgG细胞(图5g)，与Visium ST一致(图5e，f)。 作者还在人类SMG中检测到IgD+幼稚B细胞和CD3+ CD4+ T 辅助细胞（图5g）。作者假设这些不同的细胞类型共同构成了与疾病相关的免疫生态位，作者将其称为腺体相关免疫生态位(GAIN)。粘膜IgA对于预防呼吸道感染很重要，并且作者发现，在来自已发表的鼻腔、气管和支气管刷样本的单细胞数据中，2019年冠状病毒患者的IgA浆细胞比例与健康对照相比有所增加(图5h)。此外，吸烟者、囊性纤维化患者、慢性阻塞性肺病和川崎病患者的浆细胞数量增加，需要进一步研究这些情况下的GAIN。在C57/BL6小鼠气管切片中，作者没有在两个独立的小鼠队列的SMG中识别出IgA+细胞，尽管结肠中的IgA+染色如预期的那样，表明应该在人体中研究GAIN。
图5人气道中的 IgA 浆细胞与 SMG 共定位
为了了解SMG中B细胞、IgA浆细胞和T细胞的共定位，作者探索了支持 GAIN的分子机制。跨表面上皮转胞吞聚合Ig的PIGR在SMG上皮细胞中表达很高，CCL28也是如此，已知通过CCR10募集 IgA浆细胞(图6a–d)。作者通过 smFISH证实了CCL28在SMG中的表达，并通过IHC在蛋白质水平上证实了CCL28的表达(图6e)，并观察到沿近端到远端轴的表达梯度，其中CCL28在气管的 SMG 导管和浆液细胞中最高。 使用CellChat 对来自气道的细胞进行细胞-细胞相互作用分析再次证实了SMG上皮细胞和B浆细胞(组合IgA、IgG和浆母细胞)之间的CCL28-CCR10轴，并预测SMG导管细胞募集记忆和幼稚B细胞和CD4 T细胞(组合的CD4亚群，不包括Tregs)到CCL20 (图6b-d)。
图6 SMG处的细胞间信号传导用于B细胞募集和存活
除了免疫细胞募集外，作者还在GAIN中探索了支持B细胞和浆细胞功能的信号。增殖诱导配体(APRIL)是B细胞存活、分化和类别转换的重要因子，通过与B细胞上的受体TACI和BCMA相互作用的SMG导管/浆液细胞表达(图6f)。在组织中的smFISH证实了腺体中APRIL的表达，尤其是在浆液细胞中(LPO+RARRES1-APRILhigh)，通过作者在APRILhigh浆液腺中的ST分析证明特定的B和IgA共定位(图6g)。有趣的是，可以在肠上皮细胞上诱导APRIL表达，导致局部组织环境中的IgA2类别转换重组(CSR)。作者在一些记忆B细胞中发现了激活诱导的胞苷脱氨酶(AICDA) 表达，表明SMG中局部CSR的可能性。
与APRIL结合使用时，IL-6可诱导和支持长寿浆细胞，有效诱导IgA分泌并增加COPD患者的IgA分泌。在作者的数据中，SMG导管/SMG浆液细胞表达IL-6(图6g)，预计其与B血浆和CD4-naive/CD4-CM T细胞上的IL-6R/IL-6ST相互作用(图6f)。IL-6已被证明是CD4 T细胞记忆形成和克服Treg介导的抑制的必需因子。已知唾液腺上皮细胞通过IL-6诱导B细胞直接反应和通过依赖于T细胞的机制。IL-6在哮喘和COPD患者的血清和支气管肺泡灌洗液中也上调，表明 GAIN 在疾病中的重要性。
图6 SMG处的细胞间信号传导用于B细胞募集和存活
CellChat还预测了SMG上皮细胞表达的HLA基因与CD4 T 细胞(图6h，i)之间的相互作用，这表明SMG上皮细胞直接呈递抗原。HLA-DRA和HLA-DRB1在SMG导管/SMG浆液细胞中的表达在RNA水平上与纤毛细胞相当(图6i)，但在蛋白质水平上高得多(图6j)。类似地，共刺激基因CD40在SMG上皮细胞中表达（图6i)。CD4 T细胞也定位于腺体的HLA-DR高非粘液区域(图6k)。腺体中的CD4T细胞是CD45RO +(记忆)细胞，可以看到与HLA-DR高SMG上皮细胞密切相互作用，表明直接细胞-细胞相互作用(图6k)。总体而言，作者的数据表明 SMG 浆液/导管细胞可以将抗原呈递给CD4 T细胞，类似于气道和鼻腔上皮细胞，这可以在体外促进T细胞增殖。SGPlowMHCIIhigh抗原呈递小鼠实质中的上皮细胞已被证明可以调节CD4-TRM反应，有助于免疫稳态。MHCIIhighSMG上皮细胞在气道中可能具有类似的功能。
总之，作者确定了IgA浆细胞、幼稚/记忆B细胞和T细胞在浆液腺的共定位，并描述了在SMG募集和维持免疫细胞的分子信号通路。
图6 SMG处的细胞间信号传导用于B细胞募集和存活
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