FFPE单细胞+空转联合分析揭示食管鳞状细胞癌肿瘤微环境
作者：高树庚等
发表单位：中国医学科学院北京协和医学院
期刊名称：EBioMedicine
发表时间：2022
所用组学：空间转录组和单细胞转录组测序
食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）是食管癌的两种主要的亚型，其中ESCC占所有病例的大多数。这两种亚型之间的风险因素不同：酒精和吸烟与ESCC相关，而肥胖和反流与EAC相关。手术、化疗、放化疗和免疫治疗是食管癌的标准治疗方法。尽管治疗策略有所改善，但部分患者的临床治疗效果仍不佳，生存率较低。
近年来，免疫治疗已成为一种新的临床策略，是一种很有前景的食管癌治疗方法。然而，一些患者对免疫治疗没有反应，这还需要进一步的研究。肿瘤微环境（TME）是肿瘤发生和转移的重要因素，是肿瘤发生和转移的重要因素，而TME可能会影响ESCC患者对肿瘤免疫和免疫检查点抑制剂的反应。
此外，食管癌中TME存在异质性，肿瘤内的异质性可能与对特定治疗策略的不同反应密切相关。然而，很少有有效的策略对TME亚型进行分类并分析TME多样性与ESCC转移之间的关系，这阻碍了患者精确药物的开发。
单细胞转录组测序（scRNA-seq）被认为是一种划时代的方法，可以探究对不同细胞群的潜在理解，包括肿瘤中的多个细胞亚群。TME中多细胞生态系统的发现为包括ESCC在内的许多肿瘤的肿瘤内转录异质性提供了新的见解。然而，在scRNA-seq分析前的组织解离通常会导致空间信息的丢失，限制了对TME中细胞串扰的研究。空间转录组测序的发展弥补了这一点。通过利用空间转录组测序技术可以构建完整组织切片中切片不同位置的转录本信息，和单细胞测序相辅相成。
图1 实验设计
细胞图谱构建
通过对3例ESCC患者进行单细胞测序一共鉴定到了14种 clusters（图2a），包括上皮细胞、NK细胞和T细胞、内皮细胞、成纤维细胞、B细胞、单核细胞和中性粒细胞（图2c）。
图2：ESCC患者的单细胞图谱
接下来，为了评估不同细胞类型的空间分布，对3个样品的ST切片进行了H&E染色和空间转录组测序（图3）。空间转录组芯片上的spots共分成10个区域（图3d-f）。
图3：ESCC的空间转录组分析与肿瘤和基质的区域化
MIA是一种超几何分布检验方法，被用来对ST和scRNA-seq分析的结果进行整合。分析了空间区域和单细胞簇之间的联系，以确定分布在每个区域的主要细胞类型（图3g-i）。此外，以上皮细胞为主导成分的空间区域被划分为肿瘤区域（几乎所有的上皮细胞都是癌细胞），而其他区域被划分为基质区域（图3j-l）。
上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞的scRNA-seq和空间转录组学分析
通过比较每种细胞类型的亚群在癌症和基质区域之间的分布。基质细胞亚群（上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞）在这两个区域都富集。上皮细胞共鉴定出8个亚群（C0-C8），每个亚群都有独特的标记基因（图4a-c）。
图4：上皮细胞的亚群分析和MIA定位
T1样本（转移性样本）主要以C0、C1和C4亚群为代表，而非转移性样本主要包含其他亚群（图4d）。大多数上皮细胞亚群，特别是C5和C7，分布在肿瘤区域，而C4多分布在基质区域，C6没有偏好（图4e）。GSVA显示，neil3介导的ICLs分别在C5和C7亚群中显著富集，表明DNA修复可能与肿瘤发生有关（图4f）。
图4：上皮细胞的亚群分析和MIA定位
此外，根据特定的标记基因，作者还确定了成纤维细胞主要的两种亚型，即炎症性癌症相关成纤维细胞（iCAFs）和肌成纤维细胞（myCAFs）（图5a）。这两种亚型均有高表达的基因，如ACTA2和FBLN1（图5e）。
图5：成纤维细胞亚群分析和MIA定位
T1样本主要富集于iCAFs中，而myCAFs没有偏好（图5f）。iCAFs在基质区域显著富集，而myCAFs在肿瘤和基质区域均有富集（图5g）。这两个亚群的功能和途径有所不同，如myCAFs中的维生素和iCAFs中的羟基羧酸结合受体（图5h）。
图5：成纤维细胞亚群分析和MIA定位
此外，通过对3例患者的内皮细胞亚群进行分析，发现有3个具有独特标记基因的亚群。C2亚群主要富集在T1样本中，而C1亚群在非转移性样本中高度富集。此外，C2和C0亚群分别多见于肿瘤和基质区域。在上述细胞类型中发现了类似的途径富集，如neil3介导的C2亚群中的icls的分解，以及C0和C1亚群中的羟基羧酸结合受体。这些发现表明，基质细胞的分布并不相似，每种细胞类型都有其子集，可以将ESCC中的癌症和基质区域进行分层。
NK细胞和T细胞、B细胞、单核细胞和中性粒细胞的scRNA-seq和空间转录组学分析
在scRNA-seq和ST的基础上，进一步分析了一些免疫细胞的分布。然而，NK和T细胞、B细胞、单核细胞和中性粒细胞亚群在肿瘤或基质区域均不富集。NK和T细胞主要分为五种：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞、NK细胞和未指定的细胞（图6a）。
图6：NK和T细胞的亚群分析和MIA定位
3例ESCC患者的UMAP图显示了15种分类和这些细胞类型的分布，并在每个类别中显示了标记基因和高表达基因（图6d-e）。MIA显示，耗竭CD4+细胞和细胞毒性CD8+细胞在非转移性样本中大量富集，而其他细胞在所有三个样本中均富集（图6f）。在所有样本中，只有增殖性CD4+细胞在肿瘤和基质区域的富集评分相对较高，而初始CD4+、耗竭CD8+和NKT细胞主要集中在T1样本的肿瘤区域（图6g）。一些途径在NK和T细胞中富集，如耗竭CD4+细胞的细胞内氧转运（图6h）。
图6：NK和T细胞的亚群分析和MIA定位
B细胞、单核细胞和中性粒细胞共鉴定出6、9和4个亚群，每个亚群均有高表达基因。B细胞的C1-3亚群和中性粒细胞的C2亚群主要富集在T1样本中，而大多数单核细胞亚群富集在非转移性样本中。此外，MIA显示，这三种细胞类型的大多数亚群的特征基因主要富集在T1样本的肿瘤区域，表明这些亚群具有样本异质性。这三种细胞类型各亚组的GSVA均无显著性差异。
转移相关上皮细胞在空间中的分布
通过分析3例患者的ST数据，确定T1为一名淋巴结转移患者的原发部位，并收集该患者的转移样本（N1）进行scRNA-seq检测。结合T1和N1样本的单细胞数据，共将12205个细胞分为7种细胞类型（图7a）。在上皮细胞中，通过细胞亚群分析鉴定出7个亚群（图7b）。在C1和C5亚群中，都存在一些原发性和转移性来源的细胞。拟时序分析结果表明上皮细胞分为三个进化分支，其中，状态1和状态2主要包括转移性细胞，而状态3主要包括原代细胞（图7c）。这些数据被用于注释空间转录组中的Spots。状态1和状态3注释在肿瘤区域，而状态2注释在基质区域（图3j）。对T1和N1样本的拟时序分析显示，N1（转移）的上皮细胞主要分布在右分支。
图6：与转移相关的上皮细胞在空间中的分布
由状态1和状态2标注的具有集中转移细胞的空间区域分别被命名为“肿瘤区1”和“基质区1”。其余的肿瘤区和基质区分别被命名为“肿瘤区2”和“基质区2”（图7e）。肿瘤区1为治疗组，肿瘤区2为对照组。肿瘤区 1上调的140个DEGs主要富集在“细胞色素P450对异生物素的代谢”和“化学致癌”相关通路中，而下调的115个DEGs主要富集在“核糖体”相关通路中。在这些被下调的基因中，有一些基因被注释到与“谷胱甘肽代谢”、“碳代谢”和“糖酵解/糖异生”相关的通路上（图7f和图7h）。在两个基质区域，18个上调的基因富集在“氧化磷酸化”途径中，而59个下调的基因主要富集在与“ECM受体相互作用”、“局灶粘附”和“PI3K - Akt信号通路”相关的途径中（图7g和图7i）。TCGA数据的生存分析表明，肿瘤区和基质区DEGs均与总生存显著相关，而基质区DEGs则被认为与OS显著相关。DEGs预测的较高的风险水平与这两个区域较低的生存概率相关。此外，通过对每个位点的功能富集进行了评分，在两个肿瘤区之间，可观察到许多肿瘤相关通路，如Notch和TGF-b通路存在显著差异。这些通路的富集分数在肿瘤区1中明显高于在肿瘤区2中。其他途径的富集，包括上皮细胞间充质转化和血管生成，在两个基质区域之间有显著差异，基质区2富集程度较高（图8a-b）。在基质区，大多数免疫细胞在基质区2有较高的浸润，而只有浆细胞在基质区1有较高的浸润。
图8：TME内不同类型细胞的空间景观和细胞串扰
TME内不同细胞的空间景观和细胞相互作用
然后，以期通过评估不同类型细胞的空间景观，旨在探索不同细胞在TME中的潜在作用。结果表明，上皮细胞主要富集于肿瘤区域，而成纤维细胞则显著富集于基质区域（图8a-b）。B细胞、NK和T细胞在基质区域富集多于肿瘤区域。
先前的研究已经表明了细胞之间的相互作用在癌症发展中的重要性。因此，作者进一步评估了TME内细胞的细胞-细胞通信，以探索特定类型的细胞在重建ESCC患者的TME过程中的作用。研究结果显示，上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用最为显著，而上皮细胞与NK和T细胞也有很强的相互作用（图8d-e）。通过对所选的配体-受体相互作用的分析，一些免疫应答基因（如MIF）在免疫细胞中高表达，而肿瘤细胞中相应基因（特别是ACKR3）的表达相对较高，这可能在促进免疫浸润中起关键作用（图8f）。肿瘤细胞和成纤维细胞之间的串扰明显多于其他免疫细胞（图8f）。此外，还发现一些特异性的免疫基因（如SPP1、MIF和MDK）在肿瘤细胞中显著表达，其相应的受体在大多数免疫细胞中均高表达（图8g）。此外现，在TCGA队列中，与串扰相关的基因与食管癌患者的临床结局显著相关（图8h）。上述结果均通过多重荧光免疫组化染色进行了验证。总之，作者推断，一些特定的细胞通信在重塑ESCC的TME中发挥了至关重要的作用。
图8：TME内不同类型细胞的空间景观和细胞串扰
总结
在ESCC的TME中共鉴定到了7个基质细胞亚群，并在癌症和基质区域绘制了scRNA-seq确定的亚群结构。不同基质细胞及其亚群的分布异质。与免疫细胞相比，非免疫基质细胞在TME中明显富集。大多数上皮细胞亚群在癌症区域富集，而炎症性癌症相关的成纤维细胞与基质区域相关。此外，TME特征在转移性和非转移性样本之间以及转移性样本的原发性和转移性部位之间存在差异。
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