想用FFPE样本做空间转录组的老师，请看这里！（含直播回放）

一． FFPE样本空间转录组的原理

在FFPE切片样本中划定需要进行转录组分析的区域（最大面积6.5mm×6.5mm或11mm×11mm），该区域内组织经过解交联等处理后进行探针杂交，探针为左右两段能与基因mRNA互补结合的DNA序列，分别为5’端带Read 2部分序列的LHS和3’端带polyA的RHS。

一旦左右探针均与基因特异性结合，在连接酶的作用下，两段探针能连接成一段带Read 2、基因mRNA信息及polyA的DNA序列（如图1所示），以上实验均在FFPE切片上完成。

图1探针在FFPE切片内与基因特异性杂交、连接 

连接后的探针DNA序列，通过原位释放进入表达芯片对应的捕获区域内（图2），在捕获区域内探针DNA序列被芯片上oligo序列原位捕获，在DNA扩增酶作用下探针延伸形成带Read1部分序列、Spatial Barcode、UMI、基因mRNA序列信息、Read 2部分序列的产物（图3）。探针序列从FFPE切片原位释放到表达芯片上在Cytassist仪器（图4）上完成，探针的延伸在表达芯片上完成。

图2 FFPE样本空间转录组表达芯片示意图

 图3.探针的原位释放捕获延伸

 图4 Cytassist仪器示意图

洗脱产物，经过预扩增纯化后，建库纯化，质检合格后测序，最终分析获得FFPE样本的转录组信息。（图5）

图5 产物扩增、纯化、建库

二． FFPE样本准备

  白 片 

玻片要求：优先推荐国产世泰防脱玻片，大小75mm×25mm×1mm，尤其是厚度1mm不能有偏差；

切片厚度：5μm/片，若样本特殊不能满足5μm/片，可另外沟通

贴片位置：根据玻片类型选择贴片区域（图6），若超出绿色框范围，将无法进行探针原位释放

图6 FFPE样本贴片位置

三． 实验流程

选片流程

图7 FFPE样本表达区域

FFPE单细胞+空转样本准备及质控标准【解锁沉睡样本库的宝贵价值】

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