m6A联合单细胞探寻RNA甲基化修饰如何影响皮肤形态发生过程 | m6A专题

论文标题：m⁶A RNA methylation impacts fate choices during skin morphogenesis

刊登日期：2020年08月

发表杂志：eLife

影响因子：8.713

研究机构：洛克菲勒大学霍华德休斯医学研究所

技术手段：m⁶A-seq、scRNA-seq

研究背景

m⁶A甲基化修饰是哺乳动物中最丰富的RNA修饰，它依赖于环境的影响从而对RNA的代谢过程产生不同效果，RNA表达的增加或减少使体内的调控网络变得复杂。胚胎上皮组织开始是单层的多能上皮干细胞，之后发育成三个截然不同的组织：表皮、毛囊（hair follicle, HF）和皮脂腺。皮肤上皮作为一个良好的研究模型，可以揭示m⁶A修饰对形态发生影响的机制。在该研究中，作者通过研究鼠胚皮肤发生这一过程来探寻m⁶A修饰的功能。首先，作者在获取P0小鼠皮肤表皮干细胞后以单核苷酸分辨率绘制m⁶A修饰图谱，并关联之前发表的小鼠基底角质形成细胞的核糖体mRNA分析数据，探究m⁶A修饰如何与整体翻译效率相关联。在分析了m⁶A缺失对体内皮肤上皮干细胞命运选择的不同调节作用后，作者通过scRNA-seq深入地了解这种调节机制所针对的主要细胞活动，以及m⁶A修饰对皮肤上皮形态发生的这三种不同分化过程的意义。

图1

研究路线

图2

主要研究内容

01
m⁶A高度修饰的mRNA参与毛囊形态发生过程

首先，作者依据细胞特征整合素α6，使用荧光激活细胞分选 (FACS) 将P0小鼠皮肤上皮中表皮干细胞进行分选，使用单碱基水平的miCLIP测序评估了生理条件下小鼠表皮细胞中mRNA的m⁶A修饰的位置和程度。发现m⁶A修饰集中在mRNA转录本的终止密码子区域，主要代表是“DRACH”基序位点，其中m⁶A修饰主要集中在mRNA转录本的终止密码子部分（图3C-E）。结合RNA-seq数据，作者发现m⁶A修饰水平高的mRNA比m⁶A修饰水平低的mRNA更容易被翻译(图3F)。这种现象在编码序列中的最为显著。对m⁶A修饰的mRNA进行GSEA富集分析，发现ECM受体相互作用、基底细胞癌（由编码WNT和SHH信号因子的mRNA主导）和NOTCH等信号通路的高度富集，这些通路在HF形态发生中起重要作用。上述结果表明，m⁶A修饰可能促进了表皮干细胞向HF分化的命运选择（图3G-H）。

图3

02
表皮干细胞中Mettl3基因缺陷导致毛囊形态发生障碍

为了研究m⁶A缺乏对皮肤形态发生的影响，作者设置Mettl3基因敲除小鼠实验：Mettl3 conditional knockout (cKO) mice。在整个胚胎发生过程中，对照组和cKO小鼠在外观上大致相当(图4D)。然而从小鼠出生后第2天开始，cKO小鼠的表型出现异常，它们的体型和体重都在逐渐下降，并且大多数小鼠存活不超过6天。检查cKO小鼠口腔，发现牙齿和舌头都已经形成，但此时用于食物摄入所需的舌丝状乳头并没有形成。cKO小鼠的背部皮肤毛囊形态也发生了明显变化，且在Mettle表达缺陷开始，毛发基板数量减少明显（图4E-F）。上述结果表明，Mettl2基因缺陷似乎并未反映出发育延迟，而是改变了形态。值得注意的是，舌丝状乳头和皮肤毛囊的形态发生均需要WNT和SHH信号介导，而在METTL3缺失情况下，依赖于WNT信号传导的SHH信号水平是下降的。至此，作者似乎找到了m⁶A修饰与皮肤毛囊发生之间的关联性：WNT和SHH信号传导。

图4

免疫荧光结果显示，胚胎17.5天时，表皮平面内的基底(胎盘)祖细胞和发育中的皮肤毛囊中的WNThi细胞中的LEF1核显著减少（图5A）。P0时，WNThi细胞中LEF1水平在潜在的真皮凝集物(真皮乳头的前体，DP)中也减少，其WNT信号和核LEF1已知依赖于上皮WNT信号（图5B）。免疫组织化学结果显示明显的抗b-catenin核染色，而在METTL3缺失的毛囊中，b-catenin主要位于细胞间边界，反映其在贴壁连接处不依赖WNT的作用(图5C)。接下来作者通过测试SHH信号通路的激活情况，发现在没有METTL3的情况下该通路没有被阻断，但总体上是减少的，特别是在上皮中(图5D)。与METTL3 cKO皮肤中WNT信号减弱一致，变异的毛囊Oil Red O染色增加(图5E)。为了探讨表皮m⁶A缺失的长期后果，我们将P0对照和CKO仔鼠的背部皮肤移植到裸鼠身上。结果发现对照皮肤产生了厚厚的毛发，而cKO皮肤显示出惊人的毛发生长稀少(图5F，G)，表明cKO前体细胞遵循皮脂细胞与毛囊的形态发生途径(图5H)。

图5

随后，作者在超微结构水平对许多特征进行了证实，包括毛囊生长受阻和METTL3缺失的毛囊未能吞噬DP(图A)。在头发基板中，纺锤体的方向似乎在很大程度上没有改变，并且仍然垂直于下面的基底膜。并且根据phalloidin染色来显示F-肌动蛋白，面对DP的祖细胞的顶端细胞骨架极化似乎受到了扰动(图4B)。

图6

03
 m⁶A修饰的缺陷干扰了毛囊发生相关细胞的转录过程

为了进一步探究METTL3的缺失对皮肤上皮形态发生的影响，作者通过scRNA-seq分析了对照组和Mettl3 cKO组E17鼠胚YFP+表皮干细胞，基于细胞基因表达谱聚类获得七个主要细胞亚群和三个次要细胞亚群（图7A，B），有三个细胞亚群与基底表皮干细胞（Epi basal）相关，其中Krt5和Krt14高表达。而基于Krt1和Krt10的高表达，作者将一个细胞类别分类为分化的上基底角质形成表皮细胞（Epi suprabasal），这些细胞以不对称细胞分裂的形式将增殖的子细胞置于基底上层。随后作者通过拟时序分析评估表皮干细胞谱系分化轨迹，对比对照组，cKO组中表皮干细胞主要沿着两大分支分化：1、WNThi（Krt17+Lhx2+Sox9neg）和WNTlo（Krt17+Sox9+Tgfbr2+）细胞组成的毛发胚芽细胞分支；2、Krt5hiKrt14hi基底干细胞及其Krt1+Krt10+上基底干细胞的滤泡间表皮干细胞分支（图4C）。METTL3的缺失扰乱了包括WNT通路在内的转录谱，Lef1等在基底表皮干细胞和WNThi干细胞中表达均减少，上述结果表明了基底表皮干细胞在缺失m⁶A修饰的情况下阻碍了毛囊的形态发生。

图7

04
 其他发现

根据目前得到的数据，作者开始关注那些因METTL3确实而下调的RNA。发现METTL3缺失会引起信号通路和经典翻译起始因子下调（图8A，B），并通过qPCR进行了证实（图8C）。此外，Notch信号通路也在作者对基表皮祖细胞的功能丧失分析中重新出现。该通路以经典的缺口靶标HES1的表达为代表，根据整体免疫荧光的判断，HES1被减弱(图8D)。随后作者通过脉冲追逐实验发现METL3缺失的基底层祖细胞以比正常更高的速度进入基底层以上（图8E）。METTL3缺失细胞分裂的纺锤体方向基本没有改变，并保持在基底层的平面内(图8F)。尽管METTL3 CKO表皮的四个末端分化阶段仍然可以通过形态和分子标记识别，但扰动会影响到分化的后期阶段（图8G）。

图8

最后，作者转向METTL3缺失后显著上调的mRNAs，发现METTL3缺失后出现了相应的补偿机制，METTL3缺失后上调的那部分RNA代谢增强，即表现出高m⁶A修饰的mRNA通常在METTL3丢失后上调而不是下调（图9）。

图9

总结

在本研究中，作者通过绘制和分析毛囊发育过程中m⁶A修饰和单细胞转录图谱，发现m⁶A修饰增强了毛囊形态发生所需调节因子的翻译，而m⁶A修饰的缺失通过扰乱包括WNT通路在内的转录谱，从而导致皮肤毛囊形态发生缺陷。这篇文章中，作者发现了一些有关m⁶A行为的新见解，并在结合与增进我们对先前体内和体外研究中出现的某些重复主题的认识方面取得了进展。重要的是，这篇文章使m⁶A修饰成为干细胞命运选择和翻译控制的关键整合因素。

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